桃拉病毒感染对南美白对虾血液学参数的影响.docVIP

桃拉病毒感染对南美白对虾血液学参数的影响 　　摘 要：桃拉病毒（TSV）病是危害我们对虾养殖业健康发展的主要疾病之一，目前仍无切实有效的防控措施。对虾血细胞既是细胞免疫的承担者，又是体液免疫因子的提供者，研究血细胞在TSV入侵过程中的反应和变化，对提出有效防止TSV方法上有着积极意义。用TSV粗提液投喂感染南美白对虾，通过RT-PCR法，显微镜观察法研究了感染后南美白对虾发病死亡率，及总血淋巴细胞数和不同种类血细胞的比率组成变化，并检测了感染前后血浆中超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）活力的变化。结果显示，TSV感染虾发生了60%～80%的死亡率，出现典型的TSV症状，PCR证实TSV条带为阳性；而对照组仅有少量的虾只发生死亡。在TSV感染2～3d后，对虾总淋巴细胞数，透明细胞数，半颗粒细胞数及颗粒细胞数分别下降了约69%、76%、60%和70%；而SOD和PO活力分别下降了约25%和68%。这一结果显示TSV可能通过降低对虾血液学免疫力而实现其高致病性，通过提高对虾血液学指标可有效降低TSV感染的致病力。 　　关键词：南美白对虾；桃拉病毒；血细胞；免疫指标 　　中图分类号：S945.4 文献标识码：A 　　对虾桃拉病毒（TSV）是对虾养殖中危害严重的疾病之一，引起较高得到对虾死亡率，可造成对虾养殖业巨大的经济损失[1，2]。对虾感染该病后，可造成皮下、造血和淋巴等组织器官损伤，已有研究表明血细胞是TSV侵染的主要靶细胞，并在病毒对各组织器官的感染中起重要作用[3]。 　　南美白对虾血淋巴细胞既是细胞免疫的承担者，又是体液免疫的提供者，可将血淋巴细胞分为：颗粒细胞 （Granular cells， GCs）、半颗粒细胞（Semi-granular cells，GCs）和透明细胞（Hyaline cell，HCs）3类[4，5]。这3类血细胞担负着不同的免疫功能，透明细胞具有吞噬作用；半颗粒细胞含有数目可变的小细胞质颗粒和少量的酚氧化酶原，在受到异物刺激时，胞内颗粒容易脱落并发生细胞溶解，参与机体的防御反应；大颗粒细胞细胞内含大的颗粒以及大量的酚氧化酶原，在受到异物刺激时，通畅观察不到颗粒脱落，但有活性的酚氧化酶存在时，可进行胞吐作用，起到机体防御反应的作用。因此，对虾在防御反应中，3种血细胞是相互协作的。在健康对虾体内这3类血细胞的数量和比例是相对恒定的，当发生疾病时，其数量和比例将会发生变化。 　　体液免疫反应是由几种免疫反应组成的，如超氧化物歧化酶（SOD）系统、磷酸酶作用系统，及酚氧化酶（PO）作用系统等。这些免疫反应系统与细胞免疫反应协同共同发挥抗病和抗逆作用[3，6]。虽然体液免疫因子主要是在防御反应中发挥作用的分子，但是这些分子最初是由血细胞合成并储存在内的。 　　本实验研究了对虾桃拉病毒TSV粗提液对南美白对虾总血淋巴细胞数，不同种类血细胞的比例组成变化及对SOD和PO表达活性的影响，为进一步探讨血淋巴细胞的防御作用和功能提供资料，对提出有效防止TSV方法上有着积极意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　健康的南美白对虾（Litopenaeus vannamei）购自绍兴海涂对虾养殖场。对虾购回后在1000L的桶中暂养1周，暂养期间观察对虾活力及死亡情况。实验期间水温控制在28～31℃，盐度为30.0～50.0，pH为8.0～8.5；溶氧量为6.6～7.0mg/L；亚硝酸盐含量低于0.1mg/L。TSV自然感染的病虾由广西水产研究所提供，于-70℃保存。 　　1.2 对虾感染实验 　　实验选取体长7～10cm，外观健康的南美白对虾，经RT-PCR检测确定未被TSV感染。取症状明显的南美白对虾病原（PCR检测阳性）。病毒感染组直接投喂桃拉病毒（TSV）感染的病虾组织，对照组投喂新鲜虾肉，每天投喂3次，投喂30～45min后将残饵清除。 　　1.3 桃拉病毒RT-PCR 　　对疑似TSV感染的虾只进行RT-PCR检测，RNA提取和cDNA合成分别依照RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒和cDNA合成试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）操作方法；得到cDNA保存于-70℃。1μL TSV模板分别加入PCR反应体系12.5?L（2×Taq PCR MasterMix，北京艾德莱生物科技有限公司），再分别加入TSV和WSSV引物正向及反向各0.5?L，加重蒸馏水至终体积25μL。引物为：5-GCTTGCGTGGTGGGACTTA-3，5-TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG-3；TSV PCR反应条件为94℃1min，1个循环；51℃1min，72℃1min，94℃30s，35个循环；51℃1min，72℃5min，1个循环，PCR结果预计条带长度200bp。