GFP融合蛋白进行蛋白质的亚细胞定位技术总结.ppt

第三章 蛋白质定位的方法 第二节 利用绿色荧光蛋白融合蛋白法定位蛋白质的方法 学生姓名：刘栋 导师：陈育新 本节课的主要内容 蛋白质定位 绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白融合蛋白的构建 绿色荧光蛋白融合蛋白的检测 其它荧光蛋白简介 蛋白质定位 真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。 真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。 译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。 蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。理解某些蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。 蛋白质定位 蛋白质的亚细胞定位常用方法： 蔗糖密度梯度离心；免疫胶体金标记；免疫荧光；与GFP构建融合基因表达融合蛋白；多糖序列分析等。 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 2008年诺贝尔化学奖 GFP的结构特点 GFP的发光机理 GFP的荧光特性 GFP的优点 GFP的改进 GFP的应用 2008年诺贝尔化学奖 日裔美国科学家 下村修 美国科学家 马丁·查尔非 美国华裔科学家 钱永健 诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。 2008年诺贝尔化学奖 下村修：于1962年在水母Aequorea victoria发现并分离得到GFP，并发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿色。 马丁·查尔菲 ：证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。 钱永健：让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，使得同一时刻跟踪多个不同的生物学过程成为现实。 GFP的结构特点 一级结构 GFP由238个氨基酸残基组成 ,分子量为26.9kD GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位 GFP的第65、66、67位氨基酸分别是丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸，为构成GFP生色团的核心 GFP的结构特点 空间结构特点： 由 11 条β桶状结构(β- barrel) 绕成的一个圆柱体，直径约3nm，长约4nm。 一条α螺旋缠绕在圆柱体的轴位置 生色团附着在α螺旋上，几乎完美地包埋于圆柱体中心 这种方式被称为β罐 (β-can) 晶体结构 GFP的发光机理 GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础。 实质：由第65、66、67位的丝氨酸—脱水酪氨酸—甘氨酸形成对羟苯甲基咪唑环酮 GFP的荧光特性 GFP的最大吸收峰为395nm(紫外)，并有一个479nm的副峰(蓝光)；发射光谱最大峰值为509nm(绿光) 尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强，因此更适合于活体检测。 GFP的荧光特性 GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。 GFP荧光极其稳定，在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。 GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。 GFP的荧光特性 通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多具有不同发射峰和激发峰的突变体，使GFP的荧光强度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。 项目 激发峰 发射峰 野生型（wt-GFP） 红移突变体RSGFP 黄绿突变体YGFP 蓝色突变体BFP 增强型突变体OGFP 半衰期短的突变体 395 471-490 513 385 385 488 509 502-511 527 445 510 507 GFP及其主要突变体的荧光特征 nm GFP的优点 易于检测 荧光稳定 无毒害 通用性 易于构建载体 可进行活细胞定时定位观察 易于得到突变体 GFP的改进 尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点，但是野生型GFP（wt GFP）具有一定的缺点： GFP有两个激发峰影响了其特异性，并且长波激发峰强度较小，不易观察 GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折叠受温度影响大，表达量较低 GFP在某些植物细胞中并不表达 GFP的改进 除去GFP基因中隐蔽型内含子 消除编码蛋白的积累 将GFP定位到特定细胞器中 改变碱基组分 更换GFP生