高效毛细管电泳法在体内药物分析中的应用.docVIP

高效毛细管电泳法 概述 高效毛细管电泳（high performance capillary electroresis, HPCE）,是二十世纪末发展的一种高效、快速的分离分析技术。1981年Jorgenson和Lukacs创立了现代毛细管电泳；19984年 Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱；1987年Hjerten等建立了毛细管等电聚焦，Cohen和Karger等提出了毛细管凝胶电泳。八十年代末生产出第一批毛细管电泳商品仪器。由于HPCE特别适合生命科学各领域中，对多肽、蛋白质（包括酶、抗体）、核苷酸乃至脱氧核酸（DNA）的分离分析的要求，同时得到了迅速的发展。因此，在药物分析和体内药物分析中有着重要的应用与发展前景[ 1 ]。 HPCE是经典的电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。HPCE和HPLC相比，其相同处在于均为液相高效分离技术，仪器操作均可自动化，均有多种分离模式。其不同处在于：PHCE用迁移时间取代HPLC中的保留时间，HPCE的分析时间一般不超过30分钟，比HPLC的分析速度快。HPCE的柱效要比HPLC高的多，所需样品为nL（10-9L）级，流动相也只需几毫升，而HPLC所需样品为μL级，流动相则需几百毫升乃至更多。HPCE仅能用作微量制备，而HPLC可进行常量制备。 HPCE和普通电泳相比，由于HPCE采用高电场，因此分离速度要快得多；其检测器除了未能与原子吸收及红外光谱连接外，其它类型检测器均可与HPCE 连接；一般电泳定量精度差，而HPCE和HPLC相近；HPCE操作自动化程度比普通电泳要高得多。 综上所述，HPCE的优点可概括为以下五点： 1．高灵敏度 HPCE常用的紫外检测器的检测限量可达10 -3~ 10-15mol，激光诱导荧光检测器则可达10 -19~ 10-21mol。 2．高效 HPCE每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至几千万，而HPLC 一般为几千到几万。 3．快速 分离速度快，最快可在60S内完成样品的分析，也有在250S内分离30种蛋白质、1.7min分离19种阳离子及3min内分离30种阴离子的报道。 4．微量 HPCE只需nL（10-9L）级的进样量，而HPLC所需的进样量为μL级。 5．低消耗 HPCE只需少量（几毫升）流动相和价格低廉的毛细管，而HPLC 流动相则需几百毫升乃至更多和价格昂贵的色谱柱。 第2节 基本原理与装置 高效毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配系数的不同而实现分离的一类液相分离技术。 基本装置 HPCE仪的基本装置见图7-1，其结构包括一个高压电源，一根毛细管，一个检测器及 两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。 图1 HPCE仪的基本装置HPCE的仪器结构HPLC仪简单，只需高压直流电源，进样装置，毛细管和检测器。其中前三各部件均易实现，而检测器是PHCE仪中的关键的部件。因为HPCE仪中采用了极小内径的毛细管，进样量很小，故要去高灵敏度的检测方法，才能进行体内药物的定性、定量分析。 迄今为止，除了原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射谱（ICP）及红外光谱上未用于HPCE外，紫外-可见光、荧光、电化学、质谱、激光类和其它类型检测器（如折射检测器、同位素检测器等）均已应用。目前报道较多并且已经商品化的光学检测器中，应用最广泛的是紫外-可见光检测器。HPCE-MS联用技术提供了一种分离和鉴定相结合的强有力的技术，将成为HPCE中最有发展前途的技术之一。 基本原理[ 2，3 ] 在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移， 产生电泳流。HPCE通常采用的石英毛细管柱，在pH3的情况下，其内部表面带负电，和溶液接触时形成了双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子流体整体朝负极方向移动，产生电渗流。在不少情况下，电渗流的速度是泳流速度的5~7倍。 既然同时存在着泳流和渗流，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳流速度和电渗流速度的矢量和。其中正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性离子的电渗流速度为“零”，其迁移速度相于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但电渗流速度一般大于电泳流速度，故它将在中性离子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同实现了分离（见图7-2a）。 电渗流是HPCE中推动流体前进的驱动力，它使整个流体象一个塞子一样以均匀的速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞子流”。 它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。而在HPLC中采用的压力驱动方式，使柱中流体呈抛物线