水苏糖合成酶基因重组载体的构建及转化农杆菌.docVIP

水苏糖合成酶基因重组载体的构建及转化农杆菌 　　摘 要：以黄瓜叶片中提取的总RNA为模板，经PCR扩增得到长度为1 275bp的基因片断，经过酶切测序之后，将目的基因连接到表达载体，构建成重组质粒。再利用液氮冻融法将表达载体转化农杆菌感受态。 　　关键词：水苏糖合成酶基因；载体构建；转化农杆菌 　　中图分类号 Q789 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）14-20-03 　　Construction of Stachyose Synthase Gene Vector and Transformation to Agrobacterium 　　Jiang Dan et al. 　　（Heilongjiang Bayi Agriculture University，Collge of Life，Daqing 163319，China） 　　Abstract：STS gene of 1 275bp length from Cucumis sativus were cloned by RT-PCR，and were connected with cloned-vector. After sequencing and comparing with the gene showed on Genbank，absolutely accurate gene sequence which was amplied with two peculiar primier and primestar enzyme were inserted into expression vector。 STS recombined plasmid were successfully constructed，then were transformed to Agrobacterium. 　　Key words：STS gene；Expression vector construction；Transformation to Agrobacterium 　　黄瓜（Cucumis sativus L.）以水苏糖作为光合产物的主要运输形式。水苏糖合成酶（Stachyose synthase）是水苏糖生物合成的关键酶，研究水苏糖合成酶基因则是研究黄瓜糖代谢机理的第一步。因此，笔者以黄瓜为试验材料，分离了STS基因，将其连接到植物表达载体并转化农杆菌，为基因的功能鉴定及转基因研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 黄瓜品种为“中农8号”，表达载体，农杆菌菌株EHA105。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 植物RNA的提取 黄瓜叶片中RNA的提取使用天根公司的TRIZOLA+试剂盒。 　　1.2.2 RNA反转录 反转录试验使用Promega公司的试剂盒进行，在0.2mL PCR管中依次加入以下组分： 　　（1）叶片总 RNA 3μg；OligodT（18） 2μL； 70℃保持 5min，立即放回冰上。（2）5×RT MLV Buffer 5μL；10mmol/L dNTP Mix 1.25μL；Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.6μL；M-MLV Reverse Transcriptase 1μL；RNase-free water 补足至 25μL。42℃反应1h。 　　1.2.3 STS基因的克隆 按照Genbank上提供的序列设计引物，5′端引入SalⅠ酶切位点，3′端引入SpeⅠ酶切位点： 　　上游引物 5′―CGC GTCGAC ATGGACGTAGACTGAAGTCGA―3′ 　　下游引物：5′―CGC ACTAGTRRACGTAAATCGATCGGCTGA―3′ 　　PCR体系：菌液0.5μL；2x PCR master mix 10μL；上下游引物1.6μL； DNA聚合酶 0.3μL；ddH2O 7.6μL。PCR程序设置：94℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1.25min，72℃延伸10min，30循环。 　　运用中原生物公司的胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收，然后将目的片段连接克隆载体。之后将连接产物转化大肠杆菌感受态。 　　1.2.4 菌斑鉴定 挑单菌落直接接种到含有Amp的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养过夜。以菌液作为模板，用目的基因的上下游引物进行PCR反应，反应体系及条件同上。 　　1.2.5 质粒DNA提取 按照分子克隆（第三版）碱裂解法小提质粒。 　　1.2.6 STS基因质粒的酶切 （1）双酶切反应体系：10×buffer 2μL；Sal I：1μL