糙皮侧耳.pptVIP

研究背景 糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）又称平菇，是世界上第三大人工栽培的食用菌。 糙皮侧耳由双核菌丝扭结成团发育为原基即子实体分化发育是其生活史中最重要的过程。 糙皮侧耳菌丝体和原基形态比较 迄今为止,国内外对糙皮侧耳及其它一些担子菌由双核菌丝扭结成团发育为原基的过程所需的营养及外界环境条件研究得较为深入与透彻。 我们曾先后利用DDRT-PCR、SSH、cDNA文库EST等技术对糙皮侧耳菌丝体和子实体原基的差异表达基因进行了研究，并构建了糙皮侧耳菌丝体和子实体原基基因差异表达谱。 本研究在筛选糙皮侧耳菌丝体和子实体原基的LongSAGE文库过程中首次克隆到Aspartic peptidase基因全长cDNA序列，并对其进行了定量分析。 Aspartic peptidase基因cDNA 3′端的克隆 cDNA 3′端序列比对结果 Aspartic peptidase基因cDNA 5′端的克隆 cDNA 5′端序列比对结果 拼接3′端序列和5′端序列得到1 332 bp 的全长cDNA序列。 Aspartic peptidase基因的定量分析 以糙皮侧耳GAPDH基因为内参，对糙皮侧耳Aspartic peptidase的表达量进行实时荧光定量PCR检测，结果显示溶解曲线为单一峰，表明没有非特异性扩增，2-△△Ct 值大约为83，该基因在菌丝体和子实体原基阶段的表达量与LongSAGE文库结果相符。 Aspartic peptidase基因荧光定量分析溶解曲线图 Aspartic peptidase基因荧光定量分析扩增曲线图 Aspartic peptidase ORF 预测 Soft Berry软件分析Aspartic peptidase ，ORF为1 179 bp，编码392个aa。 Aspartic proteinase三维结构预测 工具： SWISS-MODEL工具 方法：同源建模方法 三维结构预测结果 序列比对一致性 Anolea（原子非局部环境评估）检测模型的健康度 Aspartic proteinase是一种重要的蛋白水解酶，在真菌的生理代谢及形态发生中起重要作用，主要通过切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键来催化蛋白质的降解。 Gropp K 等，2009年，Molecular Immunology. 利用ELISA，基因敲除等方法研究了天冬氨酸蛋白酶家族在白假丝酵母侵染人类时对免疫反应中免疫因子的降解和抑制作用。 Krysan DJ等，2005年，Eukaryotic Cell.利用基因敲除等方法研究了天冬氨酸蛋白酶在酿酒酵母细胞壁完整性维持中的促进作用。 Yike I ，2011年，Mycopathologia .概述了天冬氨酸蛋白酶在真菌病理生理过程中的作用。 Park SK等，2006年，Fungal Genetics and Biology.利用RFLP, Northern blot，QTL（数量性状遗传位点）图谱绘制等方法研究了天冬氨酸蛋白酶在糙皮侧耳蛋白质新陈代谢中的促进作用以及在子实体发育中的潜在作用。 本研究克隆的Aspartic proteinase基因，在糙皮侧耳子实体生长发育中的作用还有待进一步研究。 我们后期将利用RNAi，基因敲除技术，酵母双杂交技术等对Aspartic proteinase在糙皮侧耳子实体生长发育中的作用进行研究。 将该序列提交NCBI,BLASTn比对分析，结果表明该部分序列与GenBank中的糙皮侧耳Aspartic peptidase部分基因序列具有98%的同源性，因此认为本试验已经扩增得到Aspartic peptidase基因cDNA的5′端序列。 最小E value为2e-163（Laccaria bicolor Aspartic peptidase ）， E value为1e-159（Coprinus cinereus Aspartic peptidase ）。 参照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit说明书，以试剂盒提供的特异引物UPM为上游引物，根据3′端序列设计的特异引物ASP（A）为下游引物，利用5′ RACE技术得到1 047 bp的5′端序列。 红色正值，绿色负值，能量越高越不稳定。 与模板序列比对结果，并显示二级结构区域 参考模型1dpjA ，Chain A, The Structure Of Proteinase A Complexed With Ia3 Peptide Inhibitor 糙皮侧耳天冬氨酸蛋白酶基因的克隆及定量分析 GGCCACGCG