培训课件_PCR质量控制.ppt

上 海 市 临 床 检 验 中 心 Shanghai Centre for Clinical Laboratory 避免基因扩增检验假阴性结果的措施 避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本 定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查和校准 上 海 市 临 床 检 验 中 心 Shanghai Centre for Clinical Laboratory 注意事项 在PCR试剂准备区配置反应混合液，先将dNTP、引物、酶和缓冲液混合后，再分装； 配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡 分装的试剂注意冷藏，防止酶试剂失活及有机大分子降解 优先选择含UNG的试剂盒 试剂经充分溶解后混匀，离心后再开盖，保持试剂均匀性 扩增管、样品处理管及吸头等实验用品，均需高压灭菌 标本处理应在标本制备区指定的生物安全柜内进行，实验前应打开风机5-10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作 为防止标本间交叉污染，在打开离心管前宜短暂离心 上 海 市 临 床 检 验 中 心 Shanghai Centre for Clinical Laboratory 注意事项 如遇吸弃上清步骤的提取方法，离心时应注意离心管的方向，吸弃上清时不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。 标本处理严格按照试剂说明书进行操作，应做到处理时间充分，保证标本中的DNA或RNA完全释放； 将提取的核酸加到反应体系中后，应将纯化好的剩余核酸样本冻存，以免在扩增检测时出现意外需要重新检测。在结果确定后再将这些样本按生物污染废弃物进行处理。 扩增条件一致的不同检测项目同时扩增时不得使用同一套标准品。 扩增后的扩增管不能在扩增及产物分析区打开处理，应用一次性手套包好远离PCR实验室的洗涤间消毒处理； 工作结束后，必须立即对各工作区进行清洁 上 海 市 临 床 检 验 中 心 Shanghai Centre for Clinical Laboratory 结果判断 在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。 基线值（阈值）设定：遵从厂商规定 上 海 市 临 床 检 验 中 心 Shanghai Centre for Clinical Laboratory 实验结果有效性判断标准 标准曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数等参数的数值允许变化范围均应在试剂制造商推荐的范围内。 阴、阳室内质控检测结果均处于在控状态。 以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发放报告。否则，本次实验无效，全部标本应重新检测。 上 海 市 临 床 检 验 中 心 Shanghai Centre for Clinical Laboratory 实验灰区标本的处理 定性测定中处于实验灰区的标本应重复检测一次，灰区范围的确定及结果报告应遵从各试剂制造商推荐的要求。 复星CT：38≤Ct值40为检测灰区，建议重复检测2次。如果检测结果至少1次为Ct40判断为阳性，否则判为阴性。 达安CT: ABI7000：27≤Ct值30为检测灰区，重复检测1次。如重复试验Ct值30判为阳性，否则判为阴性。 Roche LightCycler：37≤Ct40为检测灰区，重复检测1次。如重复试验Ct值40判为阳性，否则判为阴性 上 海 市 临 床 检 验 中 心 Shanghai Centre for Clinical Laboratory 结果报告 定性检测 定性检测的结果报“阴性”或“阳性”。但由于目前国内商品试剂盒的灵敏度多为500-1000IU/ml，在报告结果时应告知临床医生方法的局限性。 定量检测 1）结果在检测范围内，则按检测的结果直接发报告。 2）样本未出现扩增曲线，则报告为“低于检测下限”，不能报告为“0”或“阴性”。如果低于检测下限，但又有扩增曲线，则应重新检测，仍低于检测下限，则报告为“低于检测下限”。 3）结果高于检测上限，则报告“高于检测上限”，如果需要精确定量结果，则应用阴性血清（浆）将样本进行100-1000倍稀释后再重新进行检测，结果乘上稀释倍数；或将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。 上 海 市 临 床 检 验 中 心 Shanghai Centre for Clinical Laboratory 有“标本