3动物细胞培养大实验.pptVIP

细胞培养 实验五 胎鼠成纤维细胞原代培养 胎鼠： 从孕鼠子宫内取出的小鼠。 成纤维细胞： 杂合细胞，因形似纤维得名，属贴附型细胞。 原代培养： 从动物体获取细胞进行的首次培养。 组织块培养 单细胞培养 无菌室 组织块培养 着装 进入无菌室前先用肥皂洗净双手，然后用1‰ 新洁尔灭浸泡消毒5分钟 将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精浸泡消毒，迅速进入无菌室。 将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔 用眼科剪和镊，将肾外膜剪破， 剪取肾组织 剪碎组织 接种组织块 移入培养箱中，静止2～3小时 （注意贴有组织块的一面朝上） 然后将细胞培养瓶轻轻翻转，继续静止培养。 单细胞培养 实验用品： 手术器件 培养皿1个 小青瓶1个 吸管1包 离心管2个 培养瓶2-3个 Hanks液 消化液 M199培养液 血清 水浴箱 血球计数板 显微镜 二氧化碳恒温培养箱。 细胞培养 实验过程 一. 取材 1. 处死母鼠，75%酒精消毒鼠体，带入无菌室。 2. 剖开腹腔，剪开子宫，每组取 1 只胎鼠。 3. 置放有Hanks液的小培养皿中去头、四肢、内脏。 4. 把胴体移入青瓶，加Hanks液少许，剪成1mm3的小块。 5. 加Hanks液吹洗，自然沉降吸弃上清液体。 重复洗涤3次，去除血细胞。 6. 移入离心管，加Hanks液至5ml，1000转/分钟 离心5分 钟，弃掉上清液。 细胞培养 二. 消化 1. 加入约3ml消化液，放入37℃水浴，消化约30分钟， 其间不时轻摇几次，待组织块变疏松、发白时取出。 2. 加入3ml 完全培养液 混匀（终止消化)，离心去上清。 3. 加入适量Hanks液，吹洗，离心去上清（除去胰酶）。 4. 再加入适量Hanks液，用吸管反复吹打，使细胞分离。 5. 静置2-5分钟，使组织块沉降，吸取上清液到另一离 心管，加Hanks液稀释到 5 ml（计数）。 细胞培养 三. 接 种 1. 离心弃上清。 2. 根据计数结果，加入适量完全培养液，调整细胞浓度 为5×105个细胞/ml，混匀装入培养瓶，每瓶约5ml溶液。 细胞数 小于 5×105， 加5ml培养液；培养一瓶 。 大于 5×105 , 小于10×105，加10ml培养液；培养二瓶。 大于10×105 ，加5ml培养液为原液，再按液比加入培养瓶（三个）。 3. 松盖放入二氧化碳恒温培养箱中培养。 4. 接种1日后，正常情况下，可见到许多细胞贴壁。 3-4 日细胞生长旺盛。若液体变色，须更换培养液。 7-10日细胞长满瓶底，可进行传代。 细胞培养 实验六 细胞计数 一. 计数板 细胞培养 实验六 细胞计数 一. 计数板 支柱 计数池（厚 0.1mm） 计数区 1mm 大 大 大 大 1mm 大格容积 = 0.1mm3 =10-4 ml 1 ml = 1000 mm3 细胞数/ml= 大格细胞数×104 每大格细胞数为50个 相当于 细胞浓度为5×105 个 / ml 盖玻片 /4 4 细胞培养 二. 计数 1. 用酒精棉球擦洗计数板，凉干，加干净盖玻片一张。 2. 吸取 2-3 滴细胞悬液，从盖片边缘缓慢滴入，使其充 满盖片和计数板间的空隙，不留气泡，且液体不流入 凹槽。 3. 将计数板置低倍显微镜下观察计数。 细胞数/ml = 4个大格内细胞总数×104 / 4。 细胞培养 三. 计数规则 3. 细胞团按一个细胞计。 2. 压线细胞 计上不计下 1. 蛇形路线计数。 计左不计右 细胞培养 实验六 细胞传代培养 培养细胞增长到一定密度，须要进行传代。既 将培养细胞从培养瓶按一定比率移到几个新培养瓶继续培养。 容纳量 细胞数量 时间 细胞培养 拐点 指数增长 传代 步骤： 清洗：取增长至80%的培养细胞，倒去培养液，加入适 量Hanks液，轻轻荡洗细胞后倒去。 消化：加入3ml消化液，37℃消化约2-3分钟，倒置