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一、噬菌体（phage） 是细菌病毒的总称。其核酸类型包括：(dsDNA , ssDNA , ssRNA)。 烈性噬菌体—只具有溶菌生长周期的噬菌体，可产生大量的子代噬菌体。 温和噬菌体—具有溶源生长周期的噬菌体，如：λ噬菌体。 构建λ噬菌体载体的基本策略 为了不突破λ噬菌体包装限制(75%-105%)．用限制性核酸内切酶切去λDNA上的非必需区（２３ｋｂ的外源基因）． 在λDNA的非必需区内插入选择标记基因 通过自然突变筛选缺失EcoRI的λ噬菌体突变体 建立重组λDNA分子的体外包装系统 柯斯质粒载体：(cosmid, cos site carrying plasmid)由λ噬菌体的cos序列与质粒构成的特殊类型的载体。 特点： 具有λ噬菌体的特性，可在体外包装后，高效转染寄主细胞。具有质粒载体的特性，可在寄主细胞内自主复制。具有高容量的克隆能力，克隆45kb外源基因。 人工染色体克隆载体实际上是一种“穿梭”克隆载体．含有质粒克隆载体所必备的第 一 受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点(ori)和选择标记基因，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。人工染色体克隆载体能容纳1000-3000kb的外源DNA片段.目前有酵母人工染色体克隆载体（YAC）、细菌人工染色体克隆载体（BAC）、人类人工染色体克隆载体（HAC）和哺乳动物人工染色体克隆载体（MAC）。 酵母人工染色体 第一种方法：利用cos位点发生突变的λ噬菌体进行体外包装． 第二种方法：为了制备体外包装重组λ DNA分子需要的各种蛋白质，筛选到了D基因缺失的λ噬菌体突变株(D-)和E基因缺失的λ噬菌体突变株(E-)。当这两种突变株分别感染受体菌时，虽然两者均能复制λ D NA分子，但是D-突变株感染的受体菌合成的系列蛋白质中缺了D蛋白，E-突变株感染的受体菌合成的系列蛋白质中缺了E蛋白‘两者均不能把复制的λ D NA分子包装成噬菌体颗粒，导致两种受体菌细胞内分别积累了除D蛋白或E蛋白以外的一系列与包装相关的蛋白质。当这两种受体菌细胞合成的蛋白质混合后，则达到D蛋白和E蛋白的互补，就能有效地包装λ DNA分子。 第三节 柯斯质粒载体 柯斯质粒载体的结构特征 1.是环型双链DNA分子,能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb--6kb）载体.用于构建基因组文库. 2.具有质粒载体的复制原点，抗药基因，多克隆位点. 3.具有λcos位点,可被A蛋白酶切开,提供体外包装的cos末端. 第三节 人工染色体克隆载体 ② 遗传标记 使受体菌发生遗传性状的改变的基因。 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。 （2）抗菌素选择原理 活 死 抗性基因 抗菌素 4. 人工构建的质粒载体的类型 （1）高拷贝数的质粒载体 ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。 可达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！ 适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。 （2）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途: 由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。 pLG338、pLG339、pHSG415等 不适合大量扩增DNA用。 （3）失控的质粒载体 这是一类温度敏感型复制控制质粒。 温度低（低于37 oC），拷贝数很少； 温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。 如pBEU1、pBEU2。 runaway plasmid vectors 1979年B. E. Uhlin等构建。 （4） 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。 注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS 2）大肠杆菌操纵子元件 阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。 1）普通载体元件 ① 表达载体的结构 五、经典的大肠杆菌质粒载体 1. pSC101 第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。 （1）类型 天然质粒，属低拷贝型。 （2）长度 9.09 kb。 （3）选择标记 四环素抗性Tetr 6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。 （其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于