第五章基因表达.pptVIP

* * 第 五 章 真核基因在E.coli中的表达 第 五 章 真核基因在E.coli中的表达 基因表达的基本问题 真核基因在大肠杆茵细胞中的表达 原核生物的表达载体 提高克隆基因表达效率的途径 第一节 基因表达的基本问题 一、转录上存在的问题 1.启动子结构上的差异 2.聚合酶的差异 3.RNA分子类型在结构上的差异 4.RNA分子类型在合成模式上的差异 5.RNA分子类型在加工上的差异 二、转译上存在的问题 1.核糖体识别信号上的差异 2.核糖体组成与结构上的差异 3.起始密码与起始氨基酸的差异 4.加工信号与加工模式上的差异 第二节 真核基因在大肠杆茵细胞中的表达 一、理论上存在的主要问题 1．真原核基因在结构上存在着很大的差别: 在一般情况下，克隆的真核基因是很难在E.coli细胞中实现功能性表达的。 2．真核基因的转录信号同原核的不同: 真核基因转录的mRNA分子，不具备结合细菌核糖体作必须的SD序列。在通常的情况下，细菌的RNA聚合酶是不能够识别真核的启动子。 3．真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异: 如真核生物5’-端的帽子结构等，这些差别都会影响到真核mRNA分子在细菌细胞中的稳定性和同细菌核糖体的结合能力，从而阻碍正常的转录和转译。 4．许多真核基因的蛋白质产物都要接受转译后的加工修饰: 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在。 5．细菌的蛋白酶: 往往能够识别外来真核基因所合成的蛋白质分子，并把它们降解掉。 二、克服的主要方法 1. 利用cDNA代替外源基因而构建cDNA克隆。由于cDNA是从基因转录物成熟的mDNA中来的，因此已切除了真核基因的内含子而克服第一个问题。 2. 将克隆的真核基因插入到原核生物启动子附近，而消除转录信号及mRNA结构不同的差异，即克服第二、第三个问题。 3. 利用化学合成结合成基因（根据掌握的蛋白质的氨基酸顺序）而代替外源基因，则在E.coli中表达后生成的蛋白质就无需加工而克服第四个问题。 4. 通过引进突变的办法或融合蛋白的方法而消除细菌蛋白酶对外源真核蛋白质的降解而消除第五个问题。 三、克隆基因表达的基本条件 1．在克隆载体分子上插入一个启动子 2．在载体分子上插入编码核糖体的结合位点序列 3．采用正确的插入取向 四、增强外源蛋白质稳定性的途径 1．形成融合蛋白质 2．使用胞内蛋白酶含量很低的E.coli突变株作为寄主细胞 3．在载体分子上插入T4的pin基因 (pin基因是蛋白酶抑制作用基因，T4pin基因表达则抑制蛋白酶基因的表达，而使外源的蛋白质变得稳定) 第三节 原核生物的表达载体 一、具有包括调节区段在内的Lac操纵子的质粒 二、trp启动子的表达载体 含有trp启动子，操纵基因、前导序列、弱化子、trpED基因的部分序列。将其片段插入到PBR322质粒的HindⅢ位点 三、PL启动子的表达载体 因此这个启动子的突出优点是只要简单地改变培养温度，就可以诱导或关闭PL启动子的活动。(CI基因，产物在42℃时失活) 每当有一个克隆的外源DNA片段插入到这个启动子之后，并保持着LacZ基因固有的读码结构时外源克隆基因编码的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质 第四节 提高克隆基因表达效率的途径 一、启动子结构对表达效率的影响 二、转译起始序列对表达效率的影响 三、启动子同克隆基因间隔距离对表达效率的影响 四、质粒拷贝数对表达效率的影响 五、转录终止区对克隆基因表达效率的影响 六、质粒分离的不稳定性对克隆基因表达效率的影响七、质粒稳定性对克隆基因表达效率的影响