第八章分子生物学技术.pptVIP

cos质粒的结构 目的基因及载体的分离 1 目的基因的获取 DNA libraries DNA libraries are sets of DNA clones, each of which has been derived from the insertion of a different fragment into a vector followed by propagation in the host. A clone is a genetically distinct individual or set of identical individuals Genomic DNA libraries CDNA libraries Genomic libraries prepared form random fragments of genomic DNA, which may be inefficient to find a gene because of the huge abundance of the non-coding DNA cDNA libraries DNA copies (cDNA) synthesized from the mRNA by reverse transcription are inserted into a vector to form a cDNA library. Much more efficient in identifying a gene, but do not contain DNA coding for functional RNA or noncoding sequence. 基因组DNA文库 限制性内切酶 基因组DNA 基因与载体重组 转化细菌 体外包装 染色体步移克隆基因 平端连接 AGCT TCGA AluⅠ DNA连接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA 平头的另外一种连接方法 重组体的转化 受体细胞 转 JM109感受态 含氨苄平板 Am 重组质粒 感受态 原核细胞的转化（细菌转化） 1)受体细胞的选择 限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型：避免重组整合 转化亲和型：较高的可转化性 遗传互补型：利于筛选 感染缺陷型：防止感染 2）转化方法 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 CaCl2处理 受体细菌 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌 基因重组 转染 体外包装 噬菌体 噬菌体体外包装 3）转化率：转化细胞/细胞总数 影响因素： 载体：载体性质、空间结构、分子大小等 受体细胞 转化过程 含氨苄平板 连接 目的基因 基因载体 连接酶 转化 重组体克隆的筛选与鉴定 筛 宿主细胞 转化后的克隆群体： 1遗传检测法 1）抗药性标志的选择 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 2）标志补救（?-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H ?片段 COOH ?片段 X-gal Lac Z 蓝色化合物 X-gal （LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 N端序列 LacZ酶 2 电泳检测法 凝胶电泳检测 加样孔 DNA Marker 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的PCR扩增片段 3 DNA序列检测 ACTGAAGGCT 基因重组过程： 重组DNA 质粒DNA 基因片段 1972年,P.Berg: 构建第一个DNA重组分子 1997年,动物克隆: 克隆羊多莉诞生 1977年，基因工程产品的出现 H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS) 1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验 2001年，人类基因组计划 pSC101 抗四环素 pR6-5 抗卡那霉素 DNA连接酶 重组DNA分子 EcoRI 抗卡那霉素基因 Boyer 和Cohen的实验 大肠杆菌 转化 抗四环素 抗卡那霉素 抗四环素\抗卡那霉素 培养平皿 卡那霉素平板 四环素\卡那霉素平板 大肠杆菌 四环素平板 人体生长激素释放激素(SS) 抑制和调节多种激素的作用 从动物脑中提取: 5mg---50万只羊脑 基因工程 9升大肠杆菌 培养液 大肠杆菌 SS蛋白 重组体 + SS基因 大肠杆菌 SS蛋白 重组体 + SS基因 目的基因 基因载体 需要克隆的DNA片段： 化学合成法 cDNA文库 基因组DNA文库 聚合酶链式反应 分 分