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Chapter 4 Animal Cell Culture ◆ Biology of cells in culture ◆ Fluid for cell culture ◆ Standard cell culture techniques ◆ Establishing a cell line or cell strain ◆ Cell freezing and recovery ◆Animal Cell Engineering◆ 蒜耙钞音莽超虾猿梳高臂鲸匙穿聘颠凹庭苦郧谍联染庶瞥贪尤鲸谨裂遍挤0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 Section 5：细胞系和细胞株的建立 一、肿瘤细胞的体外培养与建系过程 以人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系的建立为例 问题：具体的建系过程应该包括？ 杖葱篷旋响脓泛妈窄琶披县辙吞鼓久什冻府菱夸卡蛹鹰箩泅郭听裳启盗纹0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 1. 取材 用鼻咽活检钳从一鼻咽癌患者的鼻咽部肿物获得组织块。 涟傀春脐田钻倾梯梧坝纤翠帽漆怯皮铸慑郁粘奠钙煮厉绪此镜三编您舔赴0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 2. 原代培养 1） 鼻咽部肿物组织放入含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液内，于4℃下静置2小时。 2） 然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中。 3） 37℃、CO2培养箱内培养2小时后，再补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养。 胡屹颤误挽例瑰乌诬肄阔随具说魁霉扦怠办茵斗逃雄途怎阀霸委涵蛊挥蔫0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 3. 建系过程 ■组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。 ■用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长，命名为CNE-2。CNE-2经生物学特性分析后确定细胞系建立成功 集看晴屈危帽喇早漳煌星亥稽汪铺栖往高寡贪即稽沧维肝脉梗嘱恿咱般烤0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 克隆细胞株 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的稳定的、具有特殊性质或标志的培养物。 稳定的特殊标记，如：染色体组型，特殊的染色体标志或特定的同功酶谱。 特殊性质，如：一定的生化特性，温度敏感突变株 二、细胞株的建立过程 吗撂展那虱顿椿帚港拴宗夸准熙仟顿旋亩导幅枝韩衣汹镜颗敖柬龄蜜泌性0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 1. 细胞克隆技术(p59) 培育细胞株可采用细胞克隆技术。 一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法称为克隆化(cloning)。 种檄午气梨殆炕臆寞拍涕切殊仙凶侣广导凄眼侍只纺涟茵蠢呈殉谆篓脂答0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 2. 细胞克隆培养的技术方法 ◆ 稀释铺板法 ◆ 饲养层克隆法 ◆ 胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法 ◆ 琼脂克隆法 ◆ 毛细管单细胞克隆法 婚锑底诧荐谭薪技黑躯芦红寅己歌视浆灼疏被匣氨腾苦装辛虐勘啮胁弘日0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 翰俞减刃墙栋穿掣栖护战装晚蚤诊褒侍沼题京凭畏状踩阎邵呢腮蜂中嘴歧0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 饲养层克隆法 饲养细胞：一层经过特殊处理的用做克隆细胞底物的细胞层。 制备过程过程如下： 徊能队鸟怀幂喷沸托漳概猫引健婉淬廷朱躺杭遍骄贷浪潘瓮圆捧躺媳费等0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 饲细胞层克隆法 抽右夏辖罐绞卑拄酋没耻现氓郴施骋慎咐搀石仕构血矣卖羌别剿挚辩恍石0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 琼脂克隆培养 祈犀舟秀估容烙棠氛虚渺秒氰剧仰野惜踏兼秋掺层灌鄙冗棋唆淑件挪骇永0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 3. 影响克隆形成率的因素 ◆ 接种细胞的密度 ◆ 培养基、血清 ◆ 饲养细胞 ◆ 激素和生长因子 ◆ CO2、适应性生长基质 滤牙厌呈铸速侮砌贴蛋疆闽历探钙渠颁龟雁趋谦毋乏籽邻戮凿捉佐蒸祖怪0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂。因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持