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中国对虾cDNA文库的构建 1 总RNA提取 使用上海联合基因的unizol一步法提取总RNA，方法见供应商手册。 2 无RNase的DNaseI处理总RNA 加入适量单位RQ1无RNase的DNaseI （1U/per μg总RNA），反应体系包括10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCL，1.5mmol/L MgCl2，适量RNA酶抑制剂RNasin，37℃温浴30min。反应结束后，加入等体积酸性酚-氯仿（3：1）溶液，振荡混匀后，冰浴10min，4℃12000g离心20min；取水相，加入NaAC至终浓度为0.3mol/L，并加入3倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min以沉淀RNA；4℃12000g离心20min，去上清；70%乙醇悬浮清洗，真空干燥10min，溶于100μl DEPC处理的重蒸水中，取部分用于浓度及完整度检测，其余于-70℃保存。 3 总RNA浓度、完整度检测及mRNA的分离、检测 ·总RNA浓度检测 使用紫外分光光度法测定RNA的浓度：取一定量的总 RNA样品溶液，用DEPC处理的水稀释至200μl，用Backman-751型紫外分光光度计测定OD260和OD280，根据吸光值计算样品 RNA的浓度和纯度。使用DEPC处理的重蒸水校正背景。 RNA样品浓度(μg/μl)=OD260(稀释倍数(40/1000 RNA样品纯度以OD260:OD280=2.0验证RNA纯度为最高。 ·总RNA完整度的检测 5×MOPS、RNA样品制备液、RNA变性凝胶加样缓冲液、1%的甲醛变性琼脂糖凝胶的制备及RNA样品的准备均按萨姆布鲁克（1989）的方法进行，在5μl RNA溶液（约10－20μg）中加入15.5μl RNA样品制备液混匀后65°C温浴15min，立即冰浴冷却5min，加入过滤过的溴化乙锭溶液（1mg/ml）1μl，再加入2μl RNA上样缓冲液，混匀后上样。用1(RNA MOPS缓冲液为电泳缓冲液，电泳条件为100mA恒流。电泳结束后，用流水冲洗5min，使用凝胶成像系统拍照记录。mRNA的分离纯化使用的是Promega公司的PolyATtract ? Systems分离系统，检测方法同总RNA的浓度检测。 4 cDNA第一链的合成： 进行cDNA第一链合成时使用自行设计的添加上EcorI酶切位点的简并锚定引物，引物序列如下： 5’ -/C/g/g/A/A/T/T/C/g/ C / g / g / C / C/ g / C /(T)20/(ACg)1/(ACgT) 3/ -3’ 5’-/1/2/3 /4/ 5/6/ 7/ 8/ 9/10/11/12/13/14/15/16 /17-36/ 37 / 38-40 /-3’ 在该引物中，3－8号碱基是EcorI的酶切位点，17－36号碱基是PolyT，37号碱基是3个碱基组成的简并位点，38－40号碱基是4个碱基组成的简并位点。此外，在cDNA第一链合成时还参入了甲基化（5-methyl） dCTP。 在一个适当体积的无核酸酶的eppendof管中，加入mRNA(5μg) 13μl，锚定引物（3 μg）2μl，轻轻混合后，70°C变性5min，立即置于冰浴冷却，按表1顺序加入： 表1：cDNA第一链合成体系 成分 用量 10× first-strand buffer*1 5 μl First-strand methyl nucleotide mixture*2 3 μl Nuclease-Free Water 23.5 μl RNaseBlock Ribonuclease Inhibitor (40 U/μl) 1 μl M-MLV RT（200 U/μl） 2.5 μl 至此时总体积应该为 50 μl *1 10× first-strand buffer包括：500mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C)，750mM KCl，30mM MgCl 2，100mM DTT *2 First-strand methyl nucleotide mixture 包括：10 mM dATP，dGTP，and dTTP，5 mM 5-methyl dCTP) 轻轻混匀，42℃水浴保温一小时后，置于冰上放置，并开始第二链的合成。 5 cDNA第二链的合成： cDNA第二链的合成是在补充了过量的dCTP的条件下进行的（见表2，*4）。 在第一链合成的50μl反应体系中顺序按表 2加入： 表2：cDNA第二链合成体系 成分 用量 10× second-strand buffer*3 20 μl Second-strand dNTP mixture*4 6 μl Sterile