1.2基因工程的基本操作2016-6-20.ppt

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒(0.6-4um)表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 （3）花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加表达载体DNA，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单。 2 将目的基因导入动物细胞 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射受精卵 新性状动物 移植到雌性动物的输卵管或子宫内 显微注射法 3 将目的基因导入微生物细胞 （1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体溶于缓冲液与感受态细胞混合 一定温度下，感受态细胞吸收DNA分子 新性状微生物 感受态细胞：细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞 （2）方法： Ca2+转化法 改变细胞 通透性 操作：　 1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞 　　细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。 　　 2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 　　 3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。 四、目的基因的检测与鉴定 1 检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 2 鉴定: 个体生物学水平鉴定 归纳步骤 分子水平 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 1 检测 ①检测是否插入了目的基因 ——目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键 方法—— DNA分子杂交 取目的基因DNA一条链用放射性同位素作标记（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 加探针 放射性标记 A 提取受体细胞DNA B 将DNA热变性为两条单链DNA C 将单链DNA固定在膜上 D 用放射性标记的探针进行杂交 变性 附着在膜上 膜上有放射性 有杂交带 DNA 有目的基因插入 膜上无放射性 无杂交带 无目的基因插入 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ——检测目的基因是否发挥功能的第一步 方法—— 分子杂交 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 90-95℃ 55-60℃ 70-75℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 70-75℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 重复30轮后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数=2n n 循环次数 利用PCR技术扩增目的基因 70-75℃ 90-95℃ 55-60℃ PCR循环 PCR仪 微量离心管 一 次 性 吸液枪头 调节轮 卸枪头按钮 推动按钮 卸枪头器 微量移液器 Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 二、利用PCR技术扩增目的基因 P10 条件： ?模板:目的基因双链DNA ?引物：DNA单链 ?酶：耐高温Taq酶 ④原料：4种脱氧核苷酸 ⑤温度： 90-95℃、55-60℃、70-75℃ 生物53：P12 例2 （2011年江苏卷） 33．（8分）请回答基因工程方面的有关问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。 图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。 ①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。 ②在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 (2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由 （2011江苏高考33题）在第三