植物细胞悬浮培养幻灯片.pptVIP

植物细胞培养制药 （3）生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。 （4）醌类：包括蒽醌、萘醌等。 （5）蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂。植物病毒抑制剂、植物抗生素等。 （6）黄酮类：具有C6-C3-C6结构，生物合成前体是苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。多为治理心血管疾病和高血压的药物成分。 植物细胞培养制药进展 第一个专利： 1956年Routin和Nickell首次数提出利用植物细胞培养技术生产天然产物的第一个专利 工业植物生物技术 ：20世纪90年代明确提出 已经从 200余种药用植物获得了愈伤组织或细胞悬浮培养物（傅经国等，2004） 国际 日本 ：紫草 人参 红豆杉 欧美 ：美国－红豆杉； 德国－紫锥菊 国内：罗士韦 叶和春 郑光植 侯嵩生 丁家宜 利用途径生产次生代谢产物的优点 不受季节、环境、病虫害影响. 不占耕地，适用于贫瘠的地方 代谢产物生产可以在可控条件下进行,可以通过细胞株筛选、特定生物转化途径与代谢调控提高目标产物含量. 技术路线 目标植物选择 →愈伤组织诱导→→液体培养→→培养条件的优化→→反应器扩大培养 →愈伤组织诱导→→固体、液体培养→→高产细胞系筛选→→生物合成途径的研究 →器官分化（发状根）→→固体液体培养条件的优化→→反应器扩大培养→→有效成分提取、分离 植物细胞培养 是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。 是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术。 植物细胞培养的特点: ⑴大小; ⑵细胞团的形式存在; ⑶纤维素细胞壁和大液泡,易被剪切力损伤; ⑷生长缓慢 ⑸培养基成分丰富而复杂,易被微生物污染; ⑹需光、氧、二氧化碳 培养类型 按培养对象来说，可分为原生质体培养和单细胞培养； 按培养基类型可分为固体培养和液体培养； 按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养 。 植物单细胞分离和初步培养 单细胞获得： 机械法；酶解法；愈伤组织法 单细胞培养： 平板培养plating culture 看护培养法（nursing culture 饲养层培养feeding layer culture 单细胞分离方法 机械法 具体做法： 将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化 从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团 优点： 细胞不受酶伤害； 有利于进行细胞的生理和生化研究。 单细胞分离方法 酶解法 酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。 酶解法的优点 可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。 细胞平板培养（plating culture 指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman1960首创 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×103个/毫升 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。 细胞平板培养（plating culture 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数 植板率＝每个平板接种的细胞总数 细胞平板培养（plating culture 优点： ①单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。 ②由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。 看护培养（nurse culture） Muir1953首创此法获得烟草单细胞体系。 优点：简便易行，效果好。 缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。 微室培养microchamber culture 在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。由Jones等在1960年设计的。 优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程 缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。 细胞起始密度：30～80个/室。 双层滤纸植板培养 固体培养 固体培养是在培养基中加入一定量的凝固剂，经加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基。 优缺点 简便易行、所占空间小 生长的不平衡，易出现极化现象 易堆积生长过程中排出的有害物质 有些生理生化指标测定不方便 常用的固化剂 琼脂、明胶（10%）等 液体培养