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2 实验二 细菌的分离 培养及移植 1、掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 2、掌握厌氧菌培养的原理及其方法。 [细菌分离培养和移植的一般原则] 分离培养的目的是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意以下事项: 1、选择适合于所分离细菌生长的培养基。 2、确定合适的培养温度。 3、根据细菌的生长要求决定培养的气体条件。 4、要严格地进行无菌操作。 5、做好标记。 1、待检样:牛奶中细菌的分离。 2、器械:记号笔、酒精灯、接种环等。 3、培养基:普通琼脂平板、普通琼脂斜面、伊红美蓝琼脂平板、(或麦康凯琼脂平板)。 [方法与步骤] 一、需氧菌的分离培养法 此法为最常用的分离培养法。 将被检材料或混杂的材料在平板培养基上连续划线,从而使细菌分散开,以求培养后获得单个菌落。 左手持皿,用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20度左右的角度(角度越小越好,以免空气中的细菌污染培养基)。 右手持接种环,蘸取少许材料涂布于培养基边缘,然后将接种环上多余的材料烧掉,待接种环冷却后,再与所涂材料的地方轻轻接触,开始划线。 划线中线的疏密要合适,太密容易形成菌苔,过疏不能充分利用平板的表面积,也不易得到单个菌落。同时不宜过多地重复旧线,以免形成菌苔。 接种完,在皿底做好标记,平皿倒扣,置37℃培养。 首先将待分离的材料做10×的连续稀释,如10-1、10-2、10-3…等; 选择几个合适的稀释度,分别从中吸取一定量的稀释液(0.1ml),加到不同的平板培养基表面,再用灭菌玻璃推棒将液体推匀,做好标记, 置37℃培养。经培养后即可出现单个菌落。 将培养24h的平板从温箱取出,挑取单 个菌落的一部分,经染色镜检,证明不含杂菌; 用接种环挑取这个菌落剩余的部分,移植于琼脂斜面培养,得到的培养物,即为纯培养物。 两试管斜面移植时,左手持菌种管和被接种琼脂斜面管,使管口并齐,管底部放在拇指和食指之间,松动试管塞,以便接种时容易拔出。 右手持接种环,在火焰上灭菌后,用右手小指和无名指同时拔出两支管的棉塞,将管口进行火焰灭菌,使其靠近火焰。 将接种环伸入菌种管内,冷却后挑取少许细菌,拉出接种环立即伸入另一管斜面培养基上,从斜面底部开始划曲线,向上至斜面顶端为止,管口通过火焰灭菌,将试管塞好。 接种完毕,在试管壁上注明菌名、日期和接种者,置37℃温箱中培养。 二、厌氧菌的分离培养法 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离O2存在,游离O2可造成细菌的死亡,所以在培养厌氧菌时,要创造一个厌氧环境。 厌氧培养法有生物学、化学和物理学3种。 利用加热、密封、抽气等物理学方法,以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气,使其形成厌氧状态,有利于厌氧菌的生长发育。 将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中,先抽去部分空气,代以氢气至大气压。 通电,使罐中残存的氧与氢经铂或钯的催化而化合成水,使罐内氧气全部消失。 将整个厌氧罐放入温箱培养。本法适用大量的厌氧菌培养。 (2)真空干燥器法 将欲培养的平皿或试管放入真空干燥器中 ,开动抽气机,抽至高度真空后,替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进温箱培养。 (3)高层琼脂法 加热融化高层琼脂,冷至45℃左右接种厌氧菌,迅速混合均匀。冷凝后37℃培养,厌氧菌在近管底处生长。 ①厌氧肝汤培养法 培养基中含动物组织(肝块),表面盖有液体石蜡,肝块中的可氧化物质氧化而消耗氧气,液体石蜡隔绝空气,从而形成厌氧环境。 ②厌氧菌与需氧菌共同培养 是利用需氧菌的生长消耗氧气,造成厌氧环境,来培养厌氧菌的方法。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌),另一半接种厌氧菌 ,接种后将平皿用石蜡密封,倒扣置37℃恒温箱中培养2~3d后,即可观察到需氧菌和厌氧菌先后生长的现象。 利用还原作用强的化学物质,将环境或培养基内的氧气吸收,或用还原氧化型物质,降低氧化-还原电势。 (1)焦性没食子酸法 原理: 焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大量氧气 ,同时由淡棕变为深棕色的焦性没食子橙。每100cm3空间用焦性没食子酸1g及10%氢氧化钠10ml。 ①取一个干燥器,用水量出其体积。 ②按体积计算并称量出焦性没食子酸和10%氢氧化钠的用量。 ③将氢氧化钠溶液倒入干燥皿的底部,将焦性没食子酸用纸包好,用青霉素小瓶将焦性没食子酸支撑于氢氧化钠溶液上方,两种药品勿接触。 ④放上隔板,将接种好的培养皿放在隔板上。 ⑤放入一支美蓝指示剂管。 ⑥将干燥皿边缘涂一层凡士林油,并盖盖密封,轻轻摇动干燥皿,使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中,将干燥皿放入温箱培养,经2~3d,即可看到
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