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应用流式细胞仪计数水体中的微藻 　　摘 要：为了探讨流式细胞仪对不同浓度条件下微藻个数进行计数的准确度和精密度，该文应用流式细胞仪和血球计数板计数两种方法，对水体中的赤潮异湾藻数目进行不同浓度梯度的检测对比分析，可以发现，流式细胞仪计数结果的RSD值均小于5%，体现了更好的精密度，是一种可以代替血球计数板计数的快速准确的方法。 　　关键词：流式细胞仪 血球计数板 微藻 准确度 精密度 　　中图分类号：X835 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）07（a）-0196-01 　　Counting microalgae by flow cytometry 　　WU Xiaowen 　　（College of Ocean Science and Engineering，Shanghai Maritime University，Shanghai 201306，P.R.China） 　　Abstract：To discuss the accuracy and precision of microalgae counting by flow cytometry in different concentrations， this experiment researched two methods of flow cytometry and hemocytometer to make a comparative analysis about counting microalgae（Heterosigma akashiwo）in different concentrations.Flow cytometry gained RSD less than 5%，which is a fast and accurate method to replace hemocytometer. 　　Key words：flow cytometer Hemocytometer microalgae accuracy precision 　　细胞计数是医学、环境科学和生物学等领域研究中的重要环节。其在了解细胞生长状态、密度测定、环境监测等方面具有十分重要的作用和影响。用于检测单细胞微藻的方法多采用血球计数板法，但该方法费时费力，重现性较差。为了提高检测效率以及检测结果的准确度和精密度，本文尝试利用流式细胞仪计数法，选取微型浮游植物赤潮异弯藻，通过用血球计数板计数法和流式细胞仪计数法对不同浓度梯度的微藻溶液进行计算值和实测值的对比分析，验证流式细胞仪对微藻计数的准确度和精密度。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料和仪器 　　流式细胞仪染色剂Guava ViaCount（Merck Millipore），血球计数板（MARIENFELD），流式细胞仪（Partec CyFlow Cube），光学显微镜（XSP-8CA，上海），圆周振荡器（Vortex 3，IKA）。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 血球计数板计数法 　　取1 mL微藻悬液于离心管，加入160 ?L4%的戊二醛，震荡摇匀后静置5 min。试验中采用25×16格的血球计数板在显微镜下对稀释后的微藻悬液进行计数。 　　其计算公式如下：单细胞微藻数/mL=80小格内微藻个数/80×400×104×稀释倍数。 　　1.2.2 流式细胞仪计数法 　　取适量微藻培养液于离心管中振荡均匀，从中移取400 ?L藻液至3.5 mL样品管，加入适量染色剂振荡混匀并避光存放30 min，取海水稀释待测液至1.2 mL，混匀过滤后即可使用流式细胞仪进行计数。 　　其计算公式如下：单细胞微藻数/mL=仪器读出的活体微藻数/测样体积×1000×稀释倍数。 　　2 结果与讨论 　　2.1 流式细胞仪的精确度分析 　　该文采用了传统的血球计数板计数对比流式细胞仪计数，每种方法重复3次，取平均值，两种计数方法所得到的平均值非常接近，但是血球计数板多次计数所得到的各项数值偏离平均值的程度较大，其相对标准偏差RSD约为5%，而流式细胞仪精确度较好，其相对标准偏差RSD为2%，Eva L.Joachimsthal和Yingying Wang也在研究中提到了流式细胞仪的标准偏差都小于5%，能得到比较可信的结果。 　　2.2 流式细胞仪的准确度分析 　　实验设置了几组不同的浓度梯度，对异湾藻进行实验，根据测出的原始初样浓度，进行相应稀释度的理论计算和流式细胞仪计数，如图1所示，不同稀释度的计算值和实际测量值的相对标准偏差大都小于2%，拟合度比较好，说明流式细胞仪计数的精确度很高，从图中也可以看出，在不同稀释度下的计算值和实际测量值之间的差值也非常小，表明流式细胞