第6章蛋白质分离技术(精品课程课件)课件.ppt

六、蛋白质含量测定与纯度鉴定 Folin-酚法（Lowry法） 凯氏定氮法（标准方法） 紫外吸收法（280nm) Bradford法（考马斯亮蓝结合法）可测?g蛋白质 纯度鉴定：PAGE， SDS， HPLC A280/A260=1.75 * Chapter 7 蛋白质的分离、纯化和表征 一、蛋白质的酸碱性质 两性电解质 可解离基团：?-NH3+ ?-COO- 侧链上的功能基团见（书P290） 氨基酸有的化学性质蛋白质就有。 PI=正负电荷相等，净电荷为零时的pH. （见书P291表7-2） 二、蛋白质分子大小与形状 从6000—1000000Dalton(道尔顿） 为纪念原子学说（1803年）创始人John Dalton. Dalton=12C原子绝对质量1/12=1.66033?10-27 （一）最低分子量测定 （二）滲透压（Osmotic pressure）测分子量 在理想的溶液中Osmotic pressure 与溶质浓度的关系为； ?=—— C=溶质浓度 R=气体常数（0.082) T=绝对温度 ? =渗透压 CRT M M=—— RT Lim—— ? c c?o 截距 C ?/c 分子量1万——10万范围内，结果可靠 （三）蛋白质的扩散 扩散系数（diffusion coeffecient) (四） 蛋白质的沉降分析——超速离心（Ultracentrifuge)测定蛋白质分子量 1. 沉降速度法（Sedimentation velocity） 沉降系数（Sedimentation coeffecient) 10-13=Svedberg 用 S 表示，生物分子在1?10-13—200?10-13秒范围。 Hoemglobin 沉降系数4.46S=4.46 ?10-13秒 M= RTS D（ 1-?? ） （ 1-?? ）为浮力因子，其中?为偏微比容=0.74cm3/g；?=容剂密度（g/cm3) D=扩散系数 R=气体常数（8.314J/(k.mol)) T=绝对温度（K） S=沉降系数 2.沉降平衡法 M=———————— 2RTln(C2/C1) (1-??) ? 2(x22-x21) (五）凝胶过滤法（gel filtration) 分子筛效应：大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来 (五）凝胶过滤法 （gel filtration) 分子筛效应： 大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来 (六）SDS蛋白质测分子量（sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis) 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ① SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度负电荷，分子量大小与迁移率成正比。 ② SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟形的长椭圆棒型。 肌球蛋白 半乳糖苷酶 糖原磷酸化酶 牛血清白蛋白 卵清蛋白 碳酸酐酶 大豆胰蛋白酶抑制剂 溶菌酶 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀 （一）蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一种分散系统（disperse system), 蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质（disperse medium)。属胶体系统（colloidal system) 蛋白质 1. 质点大小在1-100nm范围内作Brown movement. 2. 质点带有相同电荷，相互排斥 3. 质点与溶剂形成水化层（hydration mantle),有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。 分散相质点在胶体系统中保持稳定的条件 （二）蛋白质的沉淀 破坏了上述胶体溶液的稳定条件就会沉淀。 方法：1.盐析法(salt out) (NH2)4SO4, Na2SO4, NaCl 2. 有机溶剂 甲醇，乙醇， 丙酮 3。重金属盐 pH pI时 P带负电荷与 Hg2+, Pb2+, Cu2+, Ag+形成不溶性