miR―19影响人乳腺癌MCF7细胞增殖、迁移及侵袭的研究.docVIP

miR―19影响人乳腺癌MCF7细胞增殖、迁移及侵袭的研究 　　[摘要] 目的 探讨miR-19对人乳腺癌MCF7细胞增殖、迁移及侵袭的影响。 方法 体外培养人乳腺癌MCF7细胞，分别转染pre-miR-19和miR-19抑制物，然后应用台盼蓝法检测MCF7细胞活性和增殖情况，应用transwell小室法测定MCF7细胞迁移和侵袭能力改变。 结果 pre-miR-19转染组的MCF7细胞生长抑制率下降，细胞活性和增殖能力增强，细胞迁移侵袭能力增强；miR-19抑制物转染组的MCF7细胞生长抑制率增高，细胞活性和增殖能力下降，细胞迁移侵袭能力减弱。 结论 在乳腺癌的发生发展过程中，miR-19发挥原癌基因作用，促进乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭。 　　[关键词] 人乳腺癌；miR-19；增殖；迁移 　　[中图分类号] R730 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）30-0040-02 　　乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，近年来我国乳腺癌发病呈上升趋势[1]。研究发现，乳腺癌患者的多种基因表达异常，其中包括多种非蛋白编码微小RNA（micro RNA，miR）基因异常。miR基因的表达产物为miR分子，由18～25个核苷酸组成。miR基因参与细胞增殖和分化、细胞凋亡、胚胎发育等重要生命过程，对一些疾病的发生起重要调节作用[2]。有报道称，乳腺癌患者的miR-17-92家族中的多种基因表达异常。miR-19基因是该家族基因的一个重要成员。关于miR-19基因与乳腺癌发病的作用，国内目前报道较少。本文探讨miR-19基因对人乳腺癌MCF7细胞株增殖、迁移以及侵袭的影响，为miR-19参与乳腺癌发病的分子机制理解，为miR-19作为乳腺癌早期诊断及预后预测指标提供实验依据。现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1细胞与试剂 　　人乳腺癌细胞株MCF7购自南方医科大学。DMEM培养液购自赛默飞世尔生物化学制品公司。miR反转录试剂盒和RNA提取试剂盒购自北京艾德莱生物公司。脂质体Lipofectamine 2000和MTT试剂盒购自碧云天公司。Transwell侵袭小室购自美国Costar 公司。 　　1.2 实时荧光定量PCR 　　设计miR-19基因扩增引物，委托上海生物工程有限公司合成。上游引物P1：5’-GCAGTCCTCTGTTAGTTTTGC-3’，下游引物P2：5’-GCAGGCCACCATCAGTTTT-3’。按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。以细胞总RNA为模板，应用miR反转录试剂盒进行实时荧光定量PCR。反应条件：94℃变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；72℃，5 min。 　　1.3细胞培养及转染 　　细胞采用DMEM，37℃，5% CO2培养。将4×105～8×105/mL 的MCF7细胞接种于12孔板，加含10%小牛血清的DMEM培养基，5% CO2，37℃培养，待细胞生长至70%～80%融合度，按说明书进行转染。A组（空白组）转染脂质体，B组（miR-19组）转染pre-miR-19，C组（miR-19抑制组）转染miR-19抑制物。转染后继续培养4 h，向每孔加入含10%小牛血清的DMEM，于48 h收集细胞备用。利用RT-PCR检测各组细胞miR-19含量，使用U6B作为内参基因，分析miR-19表达水平，计算公式为△Ct=Ct（miR-19）-Ct（U6B）。实验重复3次。 　　1.4台盼蓝染色法检测细胞生长抑制率 　　取转染48 h的细胞，胰酶消化后加入0.4%台盼蓝溶液，显微镜观察细胞染色情况。死细胞被染成明显蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状，分别计数活细胞和死细胞数，计算生长抑制率。生长抑制率（%）= 死细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。实验重复3次。 　　1.5 细胞活性和增殖试验 　　取转染48 h的细胞，采用MTT法检测细胞活力，应用酶标仪测定490 nm波长处吸收值，与活细胞数量呈正比。实验重复3次。 　　1.6细胞迁移及侵袭实验 　　细胞迁移实验：转染48 h后的待测细胞胰酶消化后，用无血清培养基调整浓度为2×105/mL，将细胞加入到Transwell上室中，下室加入含10%小牛血清的DMEM培养液，培养24 h，取出小室内薄膜，甲醇固定，Giemsa染色，移至载玻片上，干燥后树脂封片，显微镜观察，计算细胞迁移率。细胞侵袭实验：预先在Transwell上室底部加入稀释树胶，37℃温育其干燥，再加入待测细胞，后续操作同细胞迁移实验，计算细胞侵袭率。实验重复3次。 　　1.7 统计学处理 　　应用SPSS15.0软件进行统计分析，计量资料以（