微囊化成骨细胞诱导骨髓间充质干细胞体外成骨分化的量效研究.docVIP

微囊化成骨细胞诱导骨髓间充质干细胞体外成骨分化的量效研究 　　[摘要] 目的 探讨微囊化成骨细胞体系细胞添加量对诱导骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响。 方法 制备含有成骨细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊，与间充质干细胞的共培养，在1，7，14 d通过细胞增殖量、碱性磷酸酶活性、实时定量PCR等检测，统计结果并分析。 结果 各时段细胞增量无统计学意义；碱性磷酸酶活性随细胞浓度增加表现出递增趋势，且骨钙蛋白mRNA的表达结果基本一致。 结论 微囊化成骨细胞在低浓度下已能促进骨髓间充质干细胞成骨分化，浓度升高时促分化能力越强，但达到一定浓度后继续提高时，对成骨分化的作用则不再增强。 　　[关键词] 微囊；成骨细胞；骨髓基质干细胞；分化 　　[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）15-0004-01 　　骨缺损和骨折不愈合是骨科医生常面临的困难，骨组织工程为解决这一问题带来了希望。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal cells，BMSCs）作为骨组织工程的种子细胞已获得了广泛的认同[1]。骨髓间充质干细胞是一种具有多方向分化潜能的干细胞[2]，目前的研究表明BMSCs能够分化为成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等，不表达共刺激抗原，是一种理想的种子细胞，可以修复受损的人体组织，在组织工程和整形外科等领域具有重要的研究价值[3]。由于人体组织器官结构功能的复杂性，干细胞在植入人体前应进行体外诱导分化，从而降低临床应用的危险性[4]。基于上述前提，我们设计了以下的实验研究。 　　1 材料与方法 　　1.1成骨细胞分离培养和鉴定 　　新生SD大鼠处死后，在无菌条件下，取颅盖骨，去除软组织，将骨块剪成1～2 mm2大小后PBS溶液反复洗涤，离心（1 000 r/min，5 min），弃上清液，加入5 mL胰蛋白酶溶液（浓度为0.25%），37℃ 15 min水浴振荡消化后加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，离心（1 000 r/min，5 min），弃上清液，加入3 mL Ⅱ型胶原酶溶液（浓度1 mg/mL），在37℃水浴消化90 min，离心后除去上清液。加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液后，用吸管轻轻打散细胞沉淀，制成细胞悬液，接种于25 cm2培养瓶内于37°C，5%体积分数CO2环境中培养。48 h全量换液继续培养，每3天换1次液，待细胞融合到80%时，吸去培养基，用PBS冲洗2次后用1 mL含有0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，加入培养液终止消化，离心加培养液重悬之后，采用差速贴壁法筛选获取纯化的成骨细胞原代。待细胞集落呈70%～80%汇合时开始传代，传代3次后进行碱性磷酸酶染色鉴定。 　　1.2 骨髓间充质干细胞的分离、培养以及免疫表型、成骨分化潜能的鉴定 　　采用全骨髓贴壁法分离BMSCs：SD大鼠麻醉后常规消毒，备皮，左侧股骨大转子处作骨髓穿刺术。抽取3 mL左右骨髓置于离心管，PBS冲洗，离心（1000转/10 min）后弃上清和脂肪，洗涤2次后加入含有标准培养基的培养瓶中，37°C，5%体积分数CO2环境中培养。48 h后换液，以PBS洗涤2次，换上新鲜培养基，继续培养。每3天换液一次，待到细胞集落呈70%～80%汇合时，开始传代。 　　BMSCs的成骨分化潜能的鉴定：取第3代BMSCs接种于放有细胞爬片的6孔培养板，细胞覆盖达80%，弃去普通培养液，加入含成骨细胞诱导剂的培养液，每3天换液一次，培养2周。成骨细胞诱导剂含β-甘油磷酸钠10 mM，地塞米松10-9 M，抗坏血酸钠0.2 mM，FBS。经成骨诱导培养2周后取出细胞爬片进行碱性磷酸酶染色鉴定。 　　1.3 微囊化成骨细胞（OB-APA微囊）的制备和培养以及形态学观察 　　1.3.1 微囊化成骨细胞的制备和培养 静电液滴发生法制备OB-APA微囊：将成骨细胞与15 g/L的海藻酸钠溶液以体积比1∶10混合均匀，吸入20 mL注射器，在最优制备条件下混入0.1 mol/L CaCl2，海藻酸钙微球，静置10 min后除去上清液，生理盐水洗涤3次，将胶珠投入0.5%聚左赖氨酸震荡条件下反应5 min，生理盐水洗涤3次，再用1.5 g/L的海藻酸钠溶液振荡5 min，除去上清液并用生理盐水洗涤3次，再投入55 mmol/L柠檬酸钠液化5 min，生理盐水洗涤，即得OB-APA微囊[5]。 　　1.3.2 微囊化成骨细胞计数 采用机械破囊计数法测定制备的OB-APA微囊中的成骨细胞的量，即采用1 mL无菌注射器，内径约为330 nm 的3号针头反复抽吸微囊悬液，使微囊破碎。显微镜下观察以确定细胞已完全释放，然后