p73基因在成人急性淋巴细胞白血病中表达的研究.docVIP

p73基因在成人急性淋巴细胞白血病中表达的研究 　　【摘要】 目的：研究p73基因在急性淋巴细胞性白血病（ALL）发病机制中的作用及临床意义。方法：收集32例ALL患者及30例正常对照组骨髓样本，DNA和RNA抽提后用RT-PCR检测p73基因的表达、甲基化特异性PCR（MSP）检测p73基因第一外显子甲基化状态，并结合临床资料进行分析。结果：11例p73基因阴性表达，阴性表达率为34.38%，其中9例第一外显子区域均发生甲基化（81.82%）；21例p73基因阳性表达，32例ALL患者中，仅1例发生甲基化（4.76%）；正常对照组30例，均为p73基因阳性表达，阳性表达率为100%。p73基因的阴性表达与ALL患者的高年龄（≥60岁）、高白细胞数（≥30×109/L）及对治疗时间延长（4周取得完全缓解）有关。结论：p73基因异常表达与成人ALL的发病机制有关，具有一定的诊断及判断预后的价值；其甲基化可能是p73基因在ALL中表达沉默的主要机制。 　　【关键词】 p73 基因； 急性淋巴细胞白血病 　　急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）是造血系统恶性疾病之一，其病死率高[1]。因此，期望通过精准有效的分子生物学方法检测相关基因的改变，以探究白血病发病机制和治疗方法成为热门课题。p73基因是p53基因家族的一个新成员，具备抑癌基因的特性[2]。本文通过试验研究ALL中p73基因mRNA表达情况及其甲基化状态，以及其和临床关系，探讨p73基因在ALL发病机制中的作用及其异常表达的临床意义。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 （1）ALL组患者：2012年1月-2013年3月在本院收治的初发ALL患者32例，男17例，女15例，年龄18～74岁。参照2008年WHO诊断标准，所有患者均经临床、骨髓细胞形态及染色体学、病理学、白血病免疫分型确诊。（2）对照组：收集同期非白血病患者30例，骨髓学均正常，为对照组。两组年龄性别等一般资料比较差异均无统计学意义（P0.05），具有可比性。 　　1.2 方法 　　1.2.1 标本采集 化疗前，无菌条件下抽取ALL组及对照组患者骨髓各4 mL，Trizol（美国Gibco公司）一步法提取总RNA。骨髓标本采用离心柱法及时提取DNA。所有引物由上海生物工程公司合成。 　　1.2.2 p73基因表达分析 RT-PCR检测p73基因mRNA的表达。提取的总RNA用RT-PCR试剂盒（美国Gibco公司）按说明书合成cDNA。p73引物序列：上游5’-AGCGGAATT CACCACCATCCT-3’，下游5’-CCAGGCTCTTTCAGCTTCA-3’，产物390 bp。取1μLcDNA，以β-actin为内参，RT-PCR扩增p73基因片段，产物长度为166 bp。PCR反应条件为94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，30个循环。PCR产物用凝胶电泳分离。 　　1.2.3 甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR） 取2 μg基因组DNA，采用DNA甲基化试剂盒进行重亚硫酸盐修饰并纯化。根据p73基因第一外显子CpG岛序列特征设计甲基化特异性引物p73-MF、p73-MR和非甲基化特异性引物p73-UF、p73-UR。引物序列p73-MF：5’-GGACGTAGCGAAATCGGGGTTC-3’；p73-MR：5’-ACCCCGAACATCGACGTCCG-3’；p73-UF：5’-AGGGGATGTAGTGAAATTGGGGTTT-3’；p73-UR：5’-ATCACAACCCCAAACATCAACATCCA-3’，行甲基化特异性PCR（MSP），PCR产物用凝胶电泳分离，MSP产物大小分别是68 bp 和77 bp。 　　1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0 软件行统计学分析，计数资料采用 字2检验，等级/频数资料用Z检验，以P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 两组p73基因mRNA的检测结果比较 ALL组p73基因阴性表达率为34.38%，阳性表达率为65.62%，对照组阳性表达率为100%，两组比较差异有统计学意义（P0.01）。见表1。 　　2.2 p73基因甲基化检测结果比较 ALL组共有11位p73基因阴性表达患者，其中9例在第一外显子区域发生甲基化，而阳性表达组的21例患者中只有1例发生甲基化，两组比较差异有统计学意义（P0.01）。见表2。 　　2.3 p73基因阴性表达与ALL患者临床指标的关系 p73基因阴性表达与患者年龄、化疗前白细胞总数（WBC）和治疗反应时间均相关。4周CR者的75.00%、70.00%、66.67%，比较差异均有统