螺内酯对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响.docVIP

螺内酯对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响 　　【摘要】 目的 探讨螺内酯对大鼠心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡的影响。方法 选择30只健康SD大鼠，采用结扎冠MI/RI）前降支后再通的方法=10心肌缺血再灌注的动物模型，随机分为3组：假手术组（n=10）、缺血再灌注（MI/RI）组（n=l0）和药物组（n=10）。光镜及电镜观察标本病理形态改变，检测各组再灌注3h后心肌局部凋亡相关因子Bcl-2、Fas的表达，比较各组间差异。结果 与假手术组比较，MI/RI组中Fas含量升高（P0.01），Bcl-2含量明显减少（P0.05）；药物组较MURI组Fas含量明显降低（P0.05），Bcl-2含量明显增加（Po.os）。结论 螺内酯减轻MURI中心肌细胞凋亡程度。 　　【关键词】 缺血再灌注损伤；螺内酯；细胞凋亡；大鼠 　　文章编号：1004-7484（2014）-02-0658-02 　　生理状态下心肌内存在一定量的氧自由基（oxygen free radic，OFR），组织细胞发生缺血缺氧时氧自由基清除功能下降，生成活性增强[1]；组织恢复血液和氧供时，又可产生大量的氧自由基，以各种方式造成细胞的急慢性损伤[2]，使缺血性损伤进一步加重。多年来，医学界一直在探索有效的觖血心肌约再灌注疗法，通过恢复缺血心肌的血液供应来挽救急性缺血的心肌组织，是目前治疗急性心肌缺血及心肌梗死的主要措施：但是再灌注疗法却存在缺血再灌注损伤（MI/RI）等问题。由于心肌组织上存在大量醛固酮产物和盐皮质激素受体，因此本实验运用醛固酮拮抗剂螺内酯提前干预，探讨螺内酯是否具有减轻MI/RI时心肌细胞凋亡程度和改善心功能的作用。 　　1 资料与方法 　　1.1 材料与分组 　　1.1.1 药品和试剂螺内酯（某制药厂），Fas和Bcl-21免疫组化试剂盒（购自某生物有限公司）。 　　1.1.2 实验动物及分组采用随机平行对照的研究方法，选用清洁级SD大鼠30只（由某大学医学院动物中心提供），雌雄不限，质量200-2509，适应性饲养7d后用于实验。随机分为3组，假手术组（SHAM，n=10）、单纯缺血再灌注组（MI/RI.n=10）和螺内酯干预缺血再灌注组（SPI，凡：10）。SPI组于术前l周开始灌胃喂饲螺内酯[5mg/（kg*d），bid]，所有实验鼠术前禁食，自由饮水，以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。心肌MI/RI模型参照Simpsond的方法加以改进，开胸暴露心脏，于冠脉左前降支中1/2处穿线坏绕，结扎线向外收紧，通过肉眼观察心肌颜色判断结扎是否成功.45min后放松结扎线使冠状动脉再通形成再灌注。其中假手术组丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，所有实验动物冠状动脉再通形成后再灌注3h，后静脉注入硫喷妥钠致死动物，离断大血管，取出心脏用冰生理盐水迅速冲去心脏表面血液，剪除右心室及室间隔，选取MI/RI区标本切成4mm×4咖x6mm数块，浸入4%福尔马林固定液准备行光镜和免疫组f{=检测.另取Imm×lmm×2mm标本放人3%戊二醛固定液放人4℃冰箱中冷藏以备电镜检测。 　　1.2 检测方法 　　1.2.1 凋亡相关基因蛋白的检测再灌注3h结束后分离左心室心肌，取缺血区心肌组织，用100g/L甲醛液固定24h.常规脱水，石蜡包埋组织连续切片。以免疫组化SP法观察心肌细胞Fas、Bcl-2的表达情况。HPIAS21000图像分析系统计算4值，作为测量Fas.Bcl-2蛋白表达的半定量参数。 　　1.2.2 电镜检测取样品组织置入3%戊二醛内预固定.0.1mmo/L磷酸缓冲液洗3遍。10g/L四氧化锇酸后固定，双蒸水冲洗，逐级丙酮酸脱水，环氧树脂包埋.半薄切片，光镜观察定 　　位，超薄切片，醋酸油、柠檬酸铅双染，H-600透射电镜观察1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料以χ±s表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。 　　2 结 果 　　2.1 实验动物存活评价共计建立大鼠模型30只，术中及术后死亡3只，假手术组10只全部存活，缺血再灌注组存活8只，死亡2只，药物组存活9只，死亡1只。假手术组大鼠心脏肉眼观形态饱满，呈暗红色；MURI组大鼠心脏肉眼观梗死MURI变薄，形态僵硬，塌陷，呈乳白色；药物组整体观形态与MI/RI组无显著差异，颜色略深呈灰白色。 　　2.2 Fas和Bcl-2蛋白含量变化（A值）免疫组织化学染色后，Bcl-2和Fas蛋白阳性染色的细胞，其胞浆呈棕黄色。假手术组可见轻度的Bcl-2和Fas蛋白染色弱阳性，MI/RI组与假手术组比较bcl-2表达明显下降，Fas表达上调。药物组与MVRI组比较，螺内酯能明显减低这一现象。 　　MI/RI组Fas含量（0