应用微生物法试剂盒检测奶粉中维生素B6的含量.docVIP

应用微生物法试剂盒检测奶粉中维生素B6的含量 　　[摘要] 目的 建立应用微生物法试剂盒检测奶粉中维生素B6含量的分析方法。 方法 采用维生素B6微生物检测试剂盒定量检测奶粉中添加维生素B6的含量。 结果 维生素B6的线性范围为0.002～0.012 mg/100 g（ml），检出限为0.002 mg/100 g（ml），其标准曲线的相关系数为0.9987，相对标准偏差均10%，其回收率达到90.0%～108%。 结论 微生物法试剂盒具有灵敏度高，检出限低，线性范围宽，操作方法简便、快捷，结果准确可靠等优点，可用于奶粉中维生素B6的检测工作。 　　[关键词] 维生素B6；吡哆醇；微生物法 　　[中图分类号] R155.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0012-03 　　维生素B6是所有呈现吡哆醛生物活性的3-羟基-2-甲基吡啶衍生物的总称，主要是吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇，在自然界广泛分布，其磷酸化形式是氨基酸代谢过程的辅酶，如转氨酶的辅酶。加入食品中的维生素B6通常为盐酸吡哆醇或5-磷酸吡哆醇形式，5-磷酸吡哆醇也以维生素B6衍生物的形式天然存在于食品中。主要临床应用有：维生素B6缺乏症、婴儿惊厥、血红蛋白缺陷所致的贫血、放射病及某些抗癌药物引起的恶心、呕吐或妊娠呕吐的治疗[1]。据报道每天补充40 mg维生素B6可以防止动脉粥样硬化的发展。研究表明，当维生素B6达到一定血药浓度时，还可以与血小板表面蛋白质、纤维蛋白原及凝血酶原等凝血物质结合，从而阻止血小板聚集，防止血液凝固，延长凝血时间，使血栓不易形成，因而具有预防脑血栓的药理作用[2]。目前，市场上出售的奶粉成分中一般都含有维生素B6，特别在婴幼儿配方奶粉中是必需添加的一种维生素。测定食品中维生素B6的方法有化学法和生物法，化学法主要是仪器分析如液相色谱法[3-4]、气相色谱法[5]、荧光光度法[6-7]、紫外分光光度法[8-9]等。生物法也叫微生物法，其优势则在于：①它是以应用微生物试验对象为基础，测的是生物活性含量，更具生物学意义；②微生物作为一种活试剂，具有自身的特异性和高度的灵敏性，使测定结果较化学方法更为准确。基于这些原因，GB/T5009.154-2003将微生物法规定为测定食品中维生素B6的国家标准方法[10-11]。 　　本次研究所用的试剂盒利用微生物法的原理，将维生素B6检测培养基和稀释后的样品提取液加入包被有酿酒酵母的微孔中。酿酒酵母的生长离不开维生素B6，加入维生素B6标准品或含维生素B6的样品后，酿酒酵母开始生长直至维生素被完全消耗。30℃避光44～48 h完全孵育。酿酒酵母的代谢或生长强度与提取液中维生素B6的含量有关，可通过在610～630 nm或540～550 nm下采用酶标仪读取溶液混浊度获得，将样品浊度与标准曲线对比即可得到样品中维生素B6含量。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器 　　Sunrise酶标仪（奥地利TECAN）、电子分析天平（上海梅特勒）、离心机（上海安亭）、恒温培养箱（德国BINDER）。 　　1.2 试剂 　　VitaFast维生素B6（吡哆醇）检测试剂盒（北京博欧实德生物技术有限公司提供）；盐酸吡哆醇（维生素B6）纯度标准物质（纯度99.7%，中国计量科学研究院生产）；酸性马铃薯磷酸酶（美国Sigma生产）；枸橼酸盐缓冲液（pH4.5）：将1.5 g枸橼酸一水化合物加入100 ml烧杯中，加入50 ml无菌水，边搅拌边溶解，然后加入12 ml NaOH（1 mol/L），用0.1 mol/L HCl将pH调至4.5，将溶液定量转移至100 ml容量瓶中，用无菌水定容；实验用水均为灭菌超纯水；样品均为市售奶粉。 　　1.3 标准样品的制备 　　1.3.1 标准储备液 准确称取盐酸吡哆醇（维生素B6）纯度标准物质0.050 g，用枸橼酸盐缓冲液溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，配成50 mg/100 ml溶液，置于冰箱中保存以备用。 　　1.3.2 标准工作液 在测定时，将标准储备液按比例用枸橼酸盐缓冲液准确稀释成浓度为10 mg/100 ml、25 mg/100 ml。 　　1.4 样品处理 　　准确称取1 g均质后的样品，将其加入50 ml无菌离心管中，加入20 ml枸橼酸盐缓冲液，振荡混匀，加入10 mg酸性马铃薯磷酸酶，振荡混匀，37℃避光孵育1 h，同时间歇性振荡，用无菌水补至40 ml。振荡混匀后，在95℃水浴中提取30 min，期间应至少混合5次，然后快速冷却至30℃以下，在8000 g下离心5 min。根据维生素B6的浓度范围，在1.5 ml无菌离心管中应用无菌水对上清液进一步稀释成100倍或以上，使测定OD值在标准