PCR技术大攻略.docVIP

一、PCR技术及步骤 聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增产物的克隆?上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。二、PCR常见问题汇总? 1. ?没有得到扩增产物?? （1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。?? （2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。?? （3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。?? （4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95加热5-10分钟。?? （5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。?? （6）使用PCR试剂盒时还应注意：?? 是否严格按照说明书操作；?? 试剂使用前是否充分混匀；?? 试剂储存过久或不当而失效。?? 2. ?扩增产物在凝胶中涂布或成片状?? （1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。?? （2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。?? （3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。?? （4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。?? （5）退火温度过