姜黄素促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中活性氧表达变化研究.docVIP

姜黄素促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中活性氧表达变化研究 　　[摘要] 目的 研究姜黄素对成年大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的成骨性分化中活性氧（ROS）表达变化的影响。 方法 贴壁筛选法体外培养健康SPF级SD大鼠rBMSCs，分为四组，姜黄素组（15 μmol/L姜黄素干预），N-乙酰半胱氨酸（NAC）组（含40 mmol/L NAC），姜黄素+NAC组（含15 μmol/L姜黄素+40 mmol/L NAC），对照组（只含等体积溶剂）。比较各组间碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，骨钙素（bone glaprotein，BGP）含量和ROS相关蛋白表达变化。 结果 ①姜黄素组第4、8、12天ALP表达OD值[（35.72±0.295）、（60.44±0.347）、（51.51±0.487）]均高于对照组[（19.96±0.874）、（53.55±0.978）、（41.32±0.755）]，差异均有统计学意义（P 0.05）；NAC组和姜黄素+NAC组第4、8、12天ALP活性表达的OD值低于姜黄素组，差异均有统计学意义（P 0.05）。②姜黄素组培养12 d时BGP活性[（6.900±0.026）μg/L]高于对照组[（5.690±0.099）μg/L]，差异有统计学意义（P 0.05），说明姜黄素可明显增强rBMSCs的BGP活性。NAC组和姜黄素+NAC组的BGP活性[（5.360±0.254）、（5.500±0.232）μg/L]低于姜黄素组[（6.900±0.026）μg/L]，差异有统计学意义（P 0.05）。③rBMSCs诱导成骨化培养8 d后，姜黄素组ERK1/2，p38蛋白的表达量高于对照组，差异有统计学差异（P 0.05）；NAC组ERK1/2，p38蛋白表达量低于姜黄素组，差异有统计学意义（P 0.05）。 结论 姜黄素促进rBMSCs成骨分化过程中ROS表达量的增加。 　　[关键词] 姜黄素；骨髓间充质干细胞；成骨分化；碱性磷酸酶；骨钙素 　　[中图分类号] R394.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（c）-0024-04 　　骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）可以被诱导分化成多种间充质来源的成体细胞，包括成骨、软骨、骨髓基质、成肌及脂肪等不同细胞系。由于BMSCs具有多向分化潜能、强增殖能力、取材容易等特性，已经成为目前临床上进行基因治疗、干细胞治疗以及骨组织工程的理想的种子细胞。但是，该细胞每次分离的数量有限，而且体外自发诱导成骨性分化能力低[1-2]，因此，提高BMSCs的成骨分化率已经成为国内外研究的一个热点，它有利于获取足够的成骨种子细胞，对骨质疏松症的防治乃至整个骨组织工程的研究都具有重要意义。 　　姜黄素是一种从姜科姜黄属植物姜黄、莪术等的根茎中提取的有效成分，它具有抗肿瘤、抗氧化等多种生物学效应[3-4]。有研究发现，MAPK通路是调节干细胞成骨分化的重要信号通路，在BMSCs成骨分化中起到重要的调控作用[5-8]，那么对MAPK信号通路具有一定的影响作用的活性氧（ROS），对于姜黄素调控BMSCs成骨分化的影响如何，目前尚未见相关研究报道。因此，本研究初步探讨姜黄素促进大鼠BMSCs成骨分化中ROS的表达，为进一步研究姜黄素调控BMSCs成骨化的药理机制奠定一定的基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物和主要试剂、仪器 　　健康SPF级SD大鼠1只，3周龄，150～200 g，由广东省实验动物中心提供。磷酸化抗坏血酸（ASAP）、甘油磷酸钠、地塞米松、茜素红、二甲基亚砜（DMSO）均购于美国Sigma公司；DMEM/F12培养基（美国Gibco公司）；碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；胎牛血清（杭州四季青有限公司）。N-乙酰半胱氨酸（NAC）（美国Sigma公司）。CO2细胞培养箱（美国Thermo Revco公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；紫外分光度计和台式高速冷冻离心机（Heraeus，GEM），多功能酶标仪（美国伯乐公司）。 　　1.2 大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的培养[9-10] 　　采用颈椎脱臼法处死大鼠，在无菌条件下迅速剥离出胫骨和股骨，去除两端骨骺后采取12号针头将一定量的含肝素钠（500 U/mL）的DMEM/F12培养液迅速注入骨髓腔内，使其完全冲出骨髓，采用滴管进行反复地吹打，完全打散细胞团块，精确计数细胞，将细胞浓度调整至1.0×107/mL，接种于6孔板（2 mL/孔）。在37℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养至少60 h，弃培养