消痰散结方对MKN―45人胃癌裸鼠原位移植瘤微卫星不稳定的影响.docVIP

消痰散结方对MKN―45人胃癌裸鼠原位移植瘤微卫星不稳定的影响 　　摘要：目的 探讨消痰散结方对MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤微卫星不稳定的作用机制。方法 采用MKN-45人胃癌细胞株建立裸鼠皮下瘤模型皮下传3代作为实验模型的瘤源，采用OB胶黏合法建立人胃癌裸鼠原位移植瘤模型。20只模型裸鼠分为模型组和中药组。中药组予消痰散结方干预6周后，测瘤质量，计算抑瘤率并检测5个微卫星不稳定位点（D17S250、D2S123、D5S346、Bat-25和Bat-26）。结果 中药组的瘤质量明显低于模型组（P0.01），其抑瘤率为40.84%。模型组的肿瘤组织中能扩增到5个微卫星位点，其中微卫星位点D2S123、D5S346出现某些延长和缩短。使用消痰散结方干预6周后，微卫星位点D2S123、D5S346的变异趋于稳定。结论 消痰散结方能抑制MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤的微卫星不稳定。 　　关键词：消痰散结方；微卫星不稳定；胃癌；裸鼠 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.012 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0032-03 　　近年来，越来越多的实验研究证实微卫星不稳定（MSI）与胃癌的发生发展有密切关联[1-3]，MSI在胃癌的发生率大约为14.0%～45.0%，个别高达90.0%[4-6]。消痰散结方为本院魏品康教授多年临床经验总结，前期研究显示，消痰散结方改善晚期胃癌患者症状有效率达82.9%，卡氏评分提高率84.4%，中位生存期12.25个月，3年生存率22.10%，已获明显疗效[7]。本实验为进一步研究消痰散结方干预胃癌的作用机制，观察其对MSI的影响。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　裸鼠20只，雄性，SPF级，体质量18～20 g。购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SYXK（沪）2007-0005；使用许可证号：SYXK（沪）2007-0006。 　　1.2 药物 　　消痰散结方由天南星、半夏、全蝎、蜈蚣等组成，中药材购自上海雷允上公司，本院制剂室制备，原药材浓度为3.35 g/mL；喃氟啶：购自上海医药集团公司华联制药厂，批号060102。 　　1.3 细胞株 　　MKN-45胃癌细胞株，购自中国科学院细胞所。 　　1.4 试剂与主要仪器 　　动物组织基因组小量抽提试剂盒：High Pure PCR Template Preparation Kit，规格：1 kit （100 purifications），购自罗氏制药。测序仪试剂：Bigdye V3.1，货号：4323161，购自ABI公司。3130测序仪，购自ABI公司。9700 PCR仪，购自ABI公司。 　　2 实验方法 　　2.1 造模 　　2.1.1 细胞培养 MKN-45细胞以含10%小牛血清的RPMI- 1640培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。0.25%胰酶-乙二胺四乙酸消化后，PBS洗2次，调整细胞浓度为1×107个/mL的细胞悬液。 　　2.1.2 裸鼠皮下瘤模型建立 取1只裸鼠，将0.2 mL细胞悬液接种于右侧近腋部皮下，当皮下移植瘤长至直径约1 cm时剥取移植瘤，切成1 mm×1 mm×1 mm瘤块，再经套管针转种至另一只裸小鼠腋部皮下，如此反复进行鼠间传代。本研究以第3代皮下移植瘤为实验模型的瘤源。 　　2.1.3 人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立 在操作台上，从腋皮下剥取肿瘤组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm瘤块备用。实验动物禁食12 h，用10%水合氯醛按照裸鼠体质量0.03 mL/10 g腹腔注射麻醉后，常规手术，在胃大弯近胃窦处用1 mL无菌空针头划破胃壁浆膜层，用无齿镊将破损处向内推压，使局部胃壁形成凹龛，植入1块瘤组织于凹内，并在瘤块表面滴OB胶1滴，40 s凝固后将胃壁回纳入腹腔，0号丝线缝合腹膜及皮肤，关腹，复苏。20只荷瘤鼠均复制成功。养至6周。脱颈处死裸鼠荷瘤小鼠，分别取每只小鼠的胃肿瘤组织。 　　2.2 分组 　　选取MKN-45人胃癌皮下移植瘤裸鼠20只，分为模型组和中药组，每组10只。模型组每只给予生理盐水0.4 mL/d灌胃。中药组每只给予原药材浓度为3.35 g/mL消痰散结方0.4 mL/d灌胃，连续给药6周。 　　2.3 观察指标与方法 　　2.3.1 肿瘤组织基因组DNA提取及PCR扩增 采用RT-PCR方法。取肿瘤组织，按试剂盒说明书进行染色体抽提，然后进行PCR扩增。PCR反应体系：20 ?L。采用美国国立癌症研究所（NCI）推荐[8-9]的5个微卫星检测基因片段（D2S123、D3S1067、D3S1577、D1