实验四 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.pptVIP

生物化学与分子生物学实验（四） 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 蛋白质的含量测定 目前常用的5种经典方法： 凯式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lorry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法） （一）凯式定氮法 原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。 蛋白质含量=含氮量*6.25 蛋白质中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4，反应式为： 2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂） 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中，反应式为: (NH4)3SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量，反应式为： (NH4)2B4