使用Oligo6和PrimerPremier5.docVIP

引物设计 一、软件使用： 推荐软件：Primer Premier 5.0 优点：操作简单、显示各种参数改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等 缺点：没有明显缺点 本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar；DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). 网上同类软件：Primer3（Whitehead Institute 开发）；JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。0网站已引进并调试好这两种软件。独特之处在于：对全基因组PCR的引物设计，可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。 二、推荐操作： 引物搜索：Primer Premier 5.0 引物评价：Oligo 6.22 三、引物设计的原则: 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点： 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。 引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右。（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55－80℃之间 ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。 Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用Frq 值相对较低的片断。 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有