人肾小管上皮细胞血清饥饿法同步化方法的研究.docVIP

人肾小管上皮细胞血清饥饿法同步化方法的研究 nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp; 作者：何丽洁, 王汉民, 杨桂涛, 陈光磊, 陈威, 杨东, 刘宏宝, 白淑蓉, 沈青 【关键词】nbsp; 肾小管上皮细胞;,,同步化;,,血清饥饿法;,,G0/G1阻滞 　　; 目的: 探讨采用血清饥饿法建立将人肾小管上皮细胞（HKC）的同步化方法。方法: 将HKC分为6个不同低血清浓度组及对照组,nbsp; 分别采用胎牛血清浓度为0、 1、 2、 3、 4、 5和100 mL/L的DMEM培养液培养24 h。根据流式细胞术结果选择的最佳同步化HKC的胎牛血清浓度。将HKC的同步化处理时间分别延长为24 h、 48 h和72 h,nbsp; 选择最佳同步化时间。用MTT法绘制生长曲线观察血清饥饿处理对HKC生长的影响。采用免疫细胞化学方法验证血清饥饿同步化处理HKC的效果。结果: 选择无血清（0 mL/L）和1 mL/L为HKC最佳同步化的胎牛血清浓度,nbsp; 选择48 h为HKC同步化最佳时间。细胞生长曲线表明采用1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48 h后恢复正常培养的HKC细胞,nbsp; 其生长曲线更接近于正常培养的细胞。Brdu进一步证明,nbsp; 用1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48 h可以使90%以上的HKC细胞处于G0/G1期。结论: 用1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48 h可获得90%以上的G0/G1期HKC。 　　[关键词]肾小管上皮细胞;nbsp; 同步化;nbsp; 血清饥饿法;nbsp; G0/G1阻滞 　　肾小管萎缩和间质纤维化是终末期肾病发生和进行性恶化的主要危险因素之一,nbsp; 而肾小管萎缩和肾间质纤维化的发生与肾小管上皮细胞周期变化密切相关[1]。因此建立有效的能将肾小管上皮细胞同步化于G0期的方法,nbsp; 对研究肾小管上皮细胞增殖周期以及由此引起的再生修复或间质纤维化具有重要意义。血清饥饿法是能将细胞周期停滞于G0/G1期同时又较少影响细胞周期发育进程的一种简便有效的同步化方法[2, 3]。目前尚无关于肾小管上皮细胞成熟有效的血清饥饿同步化方法的报道。本研究旨在寻找对人肾小管上皮细胞实施血清饥饿同步化方法的最佳条件,nbsp; 从而为研究HKC增殖周期及肾间质纤维机制提供实验基础。 　　1nbsp; 材料和方法 　　1.1nbsp; 材料nbsp; 人类肾小管上皮细胞（HKC）为本实验室保存细胞系,nbsp; DMEM培养液为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。胰酶为Sigma公司产品。碘化丙啶(PI) 及胰核糖核酸酶（RNaseA）为鼎国公司产品。四唑盐（MTT）及5溴脱氧尿核苷（Brdu）为Sigma公司产品。Brdu抗体为Chemicon公司产品。SP试剂盒为北京中杉公司产品。流式细胞仪为BD公司产品。 　　1.2nbsp; 方法 　　1.2.1nbsp; 细胞培养nbsp; HKC使用的培养基为含100 mL/L胎牛血清及青霉素（50 U/mL）、 链霉素（50 U/mL）的DMEM培养液,nbsp; 培养条件为37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养[4]。（1）不同胎牛血清浓度HKC的培养:nbsp; 将HKC分为7组,nbsp; 培养至对数生长期,nbsp; 弃去培养液,nbsp; PBS洗涤3次,nbsp; 分别加入0、 1、 2、 3、 4和5 mL/L胎牛血清的DMEM培养液,nbsp; 对照组加入100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液,nbsp; 培养24 h收获细胞,nbsp; 每组重复培养3次[5]。（2）不同时间HKC的培养:nbsp; 将HKC分为6组,nbsp; 培养至对数生长期,nbsp; 弃去培养液,nbsp; PBS洗涤3次,nbsp; 分别加入0、 1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养24 h、 48 h和72 h收获细胞,nbsp; 每组重复培养3次[5]。 　　1.2.2nbsp; 细胞周期检测nbsp; 用含0.2 mL/L EDTA、 2.5 g/L胰蛋白酶消化上述各组培养细胞,nbsp; 收集于10 mL的离心管中,nbsp; 用2.5 mL PBS洗涤2次,nbsp; 1 000 r/min离心5 min,nbsp; 弃上清,nbsp; 加入0.3 mL PBS将细胞混匀,nbsp; 再加入0.6 mL无水乙醇即振荡混匀,nbsp; 置4℃冷藏备用。细胞固定24 h后用于检测。细胞样本用PBS洗涤2次,nbsp; 除去无水乙醇,nbsp; 加少量P