第二柱色谱.ppt

5.3 应用 a 蛋白质，酶，激素等大分子的分离纯化； b 蛋白质溶液脱盐，脱糖，脱脂； c 蛋白质，酶，激素等大分子的分子量测定。 5 亲和色谱 5.1 原理 利用分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使分子分离纯化的技术。 酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅助因子，抗原与抗体，RNA与互补的RNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。因此，亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用。 吸附色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱 分配色谱 定义 利用吸附剂对各组分的吸附力不同而实现分离 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而实现分离 以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而实现物质分离 利用各组分的分配系数不同而实现分离 原理 吸附作用,吸附/解吸 离子对离子交换树脂的亲和力,吸留/洗脱交换 分子筛效应 Ka=(Ve-Vo)/Vi 物质在两相间不断进行分配,抽提作用 操作 装柱―加样―洗脱 选择树脂―预处理―装柱定型―上柱―洗脱收集―再生 凝胶的选择与预处理―装柱(柱平衡)―加样与洗脱―保存 样品处理―点样(―平衡)―展开―显色―定性定量分析 洗脱/平衡方法 溶剂洗脱法/置换法/前缘分析法 置换(酸/碱/盐) 与凝胶溶涨及平衡所用液体相同 上行法、下行法、环形法 洗脱顺序 吸附力弱的最先被洗脱 对离子交换剂亲和力最小的离子最先流出 分子质量大的物质最先流出 分配系数小的物质最先流出 应用 糖类/氨基酸/多肽/有机酸/色素/核苷酸类/维生素/抗生素等 金属离子/有机酸/氨基酸 蛋白质,酶,激素等大分子的分离纯化;蛋白质溶液脱盐,脱糖,脱脂;蛋白质,酶,激素等大分子的分子量测定 糖类/氨基酸/多肽/有机酸/色素/核苷酸类/维生素/抗生素/无机离子等 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 色谱法基本原理 色谱分析的目的：将样品中各组分彼此分离。 两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相中的分配系数决定的，与色谱过程的热力学性质有关。两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，仍然不能分离。峰的宽窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学两方面研究色谱行为。 吸附层析 是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。 吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。 层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。 在洗脱时，层析柱内不断发生吸附、解吸、 再吸附、再解吸的过程 选择吸附剂时，注意: 吸附剂应有适当的吸附力，表面积大； 颗粒均匀，在操作时稳定，不会破裂； 对被吸附物的吸附应是可逆的，即在一定条件下可以解吸，以便洗脱； 不会溶解在所采用的溶剂中，也不会引起被吸附物的化学变化； 对被分离物有足够的分辨力，即对不同物质的吸附力有所不同。 吸附剂不应含有杂质，否则需经预处理后使用(除去杂质，增加吸附力，提高层析分离效果) * 离子交换层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。 按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。 凝胶层析 又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术 凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的 常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 亲和层析是利用