大豆磷脂酰胆碱测定HPLC法.docVIP

前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家粮食局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。 本标准负责起草单位：江南大学。 本标准参与起草单位： 本标准起草人：王兴国、金青哲、宋志华、刘元法、单良。 本标准为首次发布。 大豆磷脂酰胆碱的检测方法 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了大豆磷脂产品中磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine, PC）的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于含油磷脂、非含油磷脂等产品中磷脂酰胆碱的测定。 2 规范性引用文件 下列标准中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（ISO 3696:1987，neq） 3 原理 大豆磷脂产品中的磷脂酰胆碱（PC）与磷脂酰乙醇胺磷脂酰肌醇磷脂酸200 nm～214 nm波长下有较强吸收，吸收率用紫外检测器测定，采用外标法定量。 4 试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯试剂，实验用水应符合GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 正己烷：色谱纯 4.2 异丙醇：色谱纯 4.3 醋酸钠·3H2O 4.4 冰醋酸 4.5 醋酸钠溶液（0.2 M）：准确称取醋酸钠（4.3）27.22 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。 4.6 醋酸溶液（0.2 M）：准确称取冰醋酸（4.4）6.005 g，加水溶解并稀释至500 mL。 4.7 醋酸缓冲溶液（pH 4.2）：取26.5 mL 醋酸钠溶液（4.5）和73.5 mL 醋酸溶液（4.6）混合，调节pH至4.2。 4.8 磷脂酰胆碱标准品（#P6263）：Sigma公司。 5 仪器 5.1 高效液相色谱仪（配紫外检测器）。 5.2 高速离心机。 5.3 有机膜（0.45μm）。 5.4 微量进样器（25 μL，精度1 μL）。 5.5 容量瓶：10 mL，500 mL，1 000 mL。 6 样品处理 称取50 mg～250 mg磷脂样品，用流动相溶解稀释至10 mL，用高速离心机（5.2）离心，取上清液用0.45 μm膜（5.3）过滤。 7 测定 7.1 色谱柱平衡 为获得稳定的色谱分离效果，样品进样前，色谱柱需用流动相平衡（0.2 mL/min），直至基线平稳。使用后用丙酮、水、丙酮交替洗涤色谱柱，流速0.2 mL/min。 7.2 色谱条件 色谱柱：硅胶柱，200 mm×4.6 mm，粒径5 μm，或相当者； 流动相：正己烷（4.1）：异丙醇（4.2）：醋酸缓冲溶液（4.7）=8：8：1（v/v/v）； 流速：2 mL/min； 检测波长：206 nm； 柱温：30 ℃； 进样量：10 μL。 7.3 标准曲线 准确称取适量磷脂酰胆碱标准品（#P6263），用流动相溶解、稀释，配置一系列浓度的标准溶液，标准溶液中磷脂酰胆碱的浓度在0.5 mg/mL～5 mg/mL范围内。 用微量进样器（5.4）准确注入10 μL各浓度的标准溶液于高效液相色谱仪（5.1）中，记录峰面积，以峰面积对进样量绘制标准曲线。 7.4 色谱测定 用微量进样器（5.4）准确注入10 μL样品液于高效液相色谱仪（5.1）中，按照上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，样品液浓度较高时适当稀释，使响应值均在仪器检测的线性范围内，根据保留时间定性，外标法定量。 代表性磷脂样品的色谱图见附录A。 8 结果计算 8.1 计算 样品中磷脂酰胆碱的含量按（1）式计算： ………………………………………………(1) 式中： ——样品中磷脂酰胆碱的含量，单位为质量分数（%）； ——由外标法测得的样品中磷脂酰胆碱质量，单位为毫克（mg）； ——样品质量，单位为毫克（mg）。 8.2 精密度 本方法的相对标准偏差小于5%。件下回收率97.1%～101.7%。 8.4 检出限限为0.64 μg GB 1537—2002 GB 1537—2002 1 GB/T ××××—×××× GB/T ××××—×××× I 6 2 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发布 ××××-××-××实施 ××××-××-××发布 大豆磷脂酰胆碱的检测方法 高效液相色谱法 Method for determination of soybean phosphatidylcholine— High performance