【2017年整理】分子杂交的概念及基本原理.doc

分子杂交 PAGE PAGE 1 分子杂交的概念及基本原理 主要内容：一、分子杂交的概念 二、分子杂交基本原理 （一）DNA变性： 1、DNA变性的方法2、增色效应3、溶解曲线4、融解温度5、影响Tm值的因素。 （二）复性：退火 一、分子杂交的概念：分子杂交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。 利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 二、分子杂交基本原理： （一）DNA变性： DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。 1、DNA变性的方法： 1)加热； 2)改变DNA溶液的pH； 3)有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。 2、增色效应：DNA在260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect）。利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。 3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。 4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature， Tm）。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。 5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关： 1) 部因素：pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。2) 部因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。 6、DNA中的GC含量与Tm值关系： Tm = 69。3 0。41 × % （G C） 对于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4（G C） 2（A T） 实验表明DNA分子中（G C）克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系。 （二）复性：变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。 退火：通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低25～30℃左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。 复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，则不能复性。 影响复性速度的因素： 1、DNA浓度：愈高，复性速度也愈快。 2、DNA片段的大小：DNA片段愈大，扩散速度愈低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此，在复性实验中，有时将DNA切成小片段，再进行复性。 3、温度：过高不利于复性。 4、溶液的离子强度：通常盐浓度较高时，复性速度较快。 5、DNA顺序的复杂性；简单的分子复性很快，如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究，可以了解DNA顺序的复杂性。 ?核酸探针 主要内容：一、探针的概念 二、探针的种类极其选择： 1、DNA探针， 2、cDNA 探针， 3、RNA探针， 4、寡核酸探针 三、各种标记物极其选择 四、核酸探针的标记方法 五、杂交信号检测 一、探针的概念： 放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）。探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。二、探针的种类极其选择： 基因探针根据标记物不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类； 根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。 1、DNA探针： DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。