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黄芩素通过下调Ezrin,Skp2抑制肺腺癌A549细胞的生长
1.3 方法
1.3.1 细胞培养液(含10 %胎牛血清、1 %百定、1 %青霉素+链霉素)的配置:440 ml RPMI-1640培养基℃冰箱中保存。
1.3.2 细胞复苏:将需培养的A549细胞从液氮中取出后迅速放入37 ℃水浴箱中并不时摇动,使其在1 min内完全融化,在无菌超净台上用移液枪将细胞转移至离心管中,并加入15 ml培养液,混匀,放入低温离心机中以离心5 min(1000 r/min),弃去上清液并将细胞团弹松,加入适量培养液并以均匀的细胞悬液接种到培养瓶中,放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
1.3.3 细胞培养:将A549细胞以1640培养液(含10%胎牛血清)、置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育,每2~3天更换一次培养液,待细胞生长至密度80 %左右可进行传代。
1.3.4 细胞传代与冻存
1.3.4.1 细胞传代
1 吸掉培养瓶中的旧培养液,PBS洗涤三次,加入0.25 %胰蛋白酶℃、95%湿度、5 % CO2培养箱中培养2 min后与倒置显微镜下观察,可见细胞质回缩、形态变圆,细胞间距增大、连接消失,少数细胞从培养瓶底脱落,迅速加入培养液(含10 %胎牛血清)终止消化,用移液管轻轻吹打,使之成为均匀的细胞混悬液;
2 将细胞悬液置于离心管内、4℃环境1200 r/min速度下离心5 min,弃去上清液,加入培养液(含10 %胎牛血清)使细胞混匀,吸取1/10的细胞悬液于培养瓶内,继续置于37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育;
1.3.4.2 细胞冻存
1 细胞冻存液的配置:9 ml胎牛血清中加入1 ml DMSO,于4 ℃冰箱中保存。
2 冻存步骤:经胰蛋白酶消化后的细胞悬液置于于离心管中,4℃环境1200 r/min速度下离心5 min,弃去上清液并加入冻存液,将细胞团吹匀后分装至冻存管内(1 ml/管),放入T度冻存盒后于-80 ℃冰箱中冻存,24 h后将细胞转移至液氮中保存。
1.3.5 细胞计数
1 吸掉培养瓶中的旧培养液,PBS洗涤三次后加入0.25%胰蛋白酶℃、5 % CO2培养箱中消化2 min,待细胞形态变圆、间距变宽、部分细胞从瓶壁脱落后加入含10%胎牛血清的培养液终止消化,移液管吹打细胞使其从瓶壁上脱落;
2 在将细胞计数专用的盖玻片放置于计数板中央,吸取50 μl细胞悬液与50 μl台盼蓝(ml)=4大格细胞总数/4×104。℃、95 %湿度、5% CO2培养箱中培养,待细胞密度生长至50 %左右时,收集细胞;
2 弃去6孔板中的培养液,于摇床上用PBS洗涤3次,每次5 min,每孔加入1 ml无水甲醇固定细胞,4 ℃环境中静置10 min;
3 弃去无水甲醇,于摇床上用PBS洗涤3次,每次5 min;
4 用0.5 % Triton打孔,常温下静置10 min;
5 于摇床上用PBS洗涤3次,每次5 min,加入3 %BSA封闭液(1 ml/孔),常温下静置1 h;
6 于摇床上用PBS洗涤3次,每次5 min,滴加一抗Ezrin(1:100,PBS稀释)和Skp2(1:100,PBS稀释),置于4 ℃冰箱中过夜;
7 于摇床上用PBS洗涤3次,每次5 min,滴加FITC免疫荧光二抗标记目的蛋白(1:1000,PBS稀释),常温下避光静置1 h;
8 于摇床上用PBS洗涤3次,每次5 min,抗荧光淬灭封片液μl滤膜过滤,于4 ℃冰箱中避光保存待用。
2 收集对数生长期的A549细胞,将细胞悬液的浓度调整至2×103接种到96孔板中,每孔100 μl细胞悬液,分别设置空白对照组(Control)、BAI 0.1 μM组、BAI 1 μM组、BAI 10 μM组、BAI 100 μM组,每组浓度设9个平行复孔(每时间点3个复孔),置于37℃、95 %湿度、5% CO2培养箱中培养;
3 培养48 h后在接种的A549细胞中对应加入0.2 μM、2 μM、20 μM、200 μM的黄芩素100 μl,至终浓度为0.1 μM、1 μM、10 μM、100 μM,分别培养24 h、48 h、72 h后加入5mg/ml MTT溶液(每孔20 μl),继续放置于37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育(避光);
4 孵育4 h后将含MTT的培养液弃掉,加入DMSO(100 μl/孔),置于摇床上震荡10 min,使沉淀结晶物完全溶解,此过程注意避光;
5 全波长多功能酶标仪(Tecan Infinite 200 PRO)×100 %,计算半数抑制率(IC50)。
1.3.8 黄芩素对肺腺癌A549细胞形态学影响
1 将A549细胞接种于6孔板中,置于37 ℃、95 %湿度、5 % CO2培养箱中培养;
2 培养2
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