黄芩素通过下调Ezrin，Skp2抑制肺腺癌A549细胞的生长.doc

黄芩素通过下调Ezrin，Skp2抑制肺腺癌A549细胞的生长 1.3 方法 1.3.1 细胞培养液（含10 %胎牛血清、1 %百定、1 %青霉素+链霉素）的配置：440 ml RPMI-1640培养基℃冰箱中保存。 1.3.2 细胞复苏：将需培养的A549细胞从液氮中取出后迅速放入37 ℃水浴箱中并不时摇动，使其在1 min内完全融化，在无菌超净台上用移液枪将细胞转移至离心管中，并加入15 ml培养液，混匀，放入低温离心机中以离心5 min（1000 r/min），弃去上清液并将细胞团弹松，加入适量培养液并以均匀的细胞悬液接种到培养瓶中，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。 1.3.3 细胞培养：将A549细胞以1640培养液（含10%胎牛血清）、置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，每2~3天更换一次培养液，待细胞生长至密度80 %左右可进行传代。 1.3.4 细胞传代与冻存 1.3.4.1 细胞传代 1 吸掉培养瓶中的旧培养液，PBS洗涤三次，加入0.25 %胰蛋白酶℃、95%湿度、5 % CO2培养箱中培养2 min后与倒置显微镜下观察，可见细胞质回缩、形态变圆，细胞间距增大、连接消失，少数细胞从培养瓶底脱落，迅速加入培养液（含10 %胎牛血清）终止消化，用移液管轻轻吹打，使之成为均匀的细胞混悬液； 2 将细胞悬液置于离心管内、4℃环境1200 r/min速度下离心5 min，弃去上清液，加入培养液（含10 %胎牛血清）使细胞混匀，吸取1/10的细胞悬液于培养瓶内，继续置于37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育； 1.3.4.2 细胞冻存 1 细胞冻存液的配置：9 ml胎牛血清中加入1 ml DMSO，于4 ℃冰箱中保存。 2 冻存步骤：经胰蛋白酶消化后的细胞悬液置于于离心管中，4℃环境1200 r/min速度下离心5 min，弃去上清液并加入冻存液，将细胞团吹匀后分装至冻存管内（1 ml/管），放入T度冻存盒后于-80 ℃冰箱中冻存，24 h后将细胞转移至液氮中保存。 1.3.5 细胞计数 1 吸掉培养瓶中的旧培养液，PBS洗涤三次后加入0.25%胰蛋白酶℃、5 % CO2培养箱中消化2 min，待细胞形态变圆、间距变宽、部分细胞从瓶壁脱落后加入含10%胎牛血清的培养液终止消化，移液管吹打细胞使其从瓶壁上脱落； 2 在将细胞计数专用的盖玻片放置于计数板中央，吸取50 μl细胞悬液与50 μl台盼蓝（ml）=4大格细胞总数/4×104。℃、95 %湿度、5% CO2培养箱中培养，待细胞密度生长至50 %左右时，收集细胞； 2 弃去6孔板中的培养液，于摇床上用PBS洗涤3次，每次5 min，每孔加入1 ml无水甲醇固定细胞，4 ℃环境中静置10 min； 3 弃去无水甲醇，于摇床上用PBS洗涤3次，每次5 min； 4 用0.5 % Triton打孔，常温下静置10 min； 5 于摇床上用PBS洗涤3次，每次5 min，加入3 %BSA封闭液（1 ml/孔），常温下静置1 h； 6 于摇床上用PBS洗涤3次，每次5 min，滴加一抗Ezrin（1：100，PBS稀释）和Skp2（1：100，PBS稀释），置于4 ℃冰箱中过夜； 7 于摇床上用PBS洗涤3次，每次5 min，滴加FITC免疫荧光二抗标记目的蛋白（1：1000，PBS稀释），常温下避光静置1 h； 8 于摇床上用PBS洗涤3次，每次5 min，抗荧光淬灭封片液μl滤膜过滤，于4 ℃冰箱中避光保存待用。 2 收集对数生长期的A549细胞，将细胞悬液的浓度调整至2×103接种到96孔板中，每孔100 μl细胞悬液，分别设置空白对照组（Control）、BAI 0.1 μM组、BAI 1 μM组、BAI 10 μM组、BAI 100 μM组，每组浓度设9个平行复孔（每时间点3个复孔），置于37℃、95 %湿度、5% CO2培养箱中培养； 3 培养48 h后在接种的A549细胞中对应加入0.2 μM、2 μM、20 μM、200 μM的黄芩素100 μl，至终浓度为0.1 μM、1 μM、10 μM、100 μM，分别培养24 h、48 h、72 h后加入5mg/ml MTT溶液（每孔20 μl），继续放置于37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育（避光）； 4 孵育4 h后将含MTT的培养液弃掉，加入DMSO（100 μl/孔），置于摇床上震荡10 min，使沉淀结晶物完全溶解，此过程注意避光； 5 全波长多功能酶标仪（Tecan Infinite 200 PRO）×100 %，计算半数抑制率（IC50）。 1.3.8 黄芩素对肺腺癌A549细胞形态学影响 1 将A549细胞接种于6孔板中，置于37 ℃、95 %湿度、5 % CO2培养箱中培养； 2 培养2