探讨在HBV相关性肝脏疾病中外周血的骨桥蛋白(OPN)、白介素-12及白介素-18的表达水平及其临床意义.docVIP

摘 要 目的：探讨在HBV相关性肝脏疾病中外周血的骨桥蛋白(OPN)、白介素-12及白介素-18的表达水平及其临床意义。 方法：应用ELISA方法测定15例健康献血者（对照组）和62例HBV相关性肝脏疾病患者和的外周血中的白介素-12、白介素-18及骨桥蛋白的表达水平，并分析其相关性。 结果：骨桥蛋白在肝炎组、肝硬化组以及原发性肝癌组中的表达水平均显著高于正常对照组的表达水平，与正常对照组相比 P 0.05；骨桥蛋白在不同HBV相关性疾病中原发性肝癌组表达水平最高，之后为肝硬化组，肝炎组的表达水平最少；慢性乙型肝炎患者血清按不同胆红素水平分为三组，血清中TBIL水平与OPN、IL-12及18表达呈正相关（r＝0.45，P＜0.01；r＝0.48，P＜0.05；r＝0.79，P＜0.05）。在HBV-DNA复制程度对外周血骨桥蛋白及白介素-18表达水平无明显差异，但与白介素-12表达水平有显著差异。 结论：骨桥蛋白、白介素-12及白介素-18在HBV相关性肝脏疾病中的表达不同，与其发生、发展及预后有关。 关键词：骨桥蛋白；白介素-12；白介素-18；Th1/Th2；ELISA；  第一章 前 言 与方法 2.1 材料与对象 病例选择：收集在延边大学附属医院2011年1月到2012年12月，门诊以及住院的乙型肝炎、肝硬化以及肝癌等肝脏疾病患者的血清。分为21例单纯肝炎组（男性为13例，女性为8例），其年龄范围是19到62岁(年龄平均为34.8)；21例乙型肝炎肝硬化组（男性为14例，女性为7例），其年龄范围是26到73 岁(年龄平均问59.8)；20例原发性肝癌组（男性为12例，女性为8例），其年龄范围是41到78岁(年龄平均为51.7),15例正常对照组（其中男性为7例，女性为8例），其年龄范围是21到32岁(年龄平均为24.1)。诊断均符合慢性乙型肝炎防治指南中标出的诊断标准。 2.2 血清标本采集 使用不含热原和内毒素的空白试管，并且避免在操作过程中细胞受到刺激，收集正常对照组及HBV相关性肝脏疾病患者的空腹静脉血，然后进行离心20分钟左右（3000转/分），随之迅速且仔细收集上清液。按一次用量分装后冷冻保存（-75℃）待检测。应注意避免反复冻融，使用标本之前应在室温下充分解冻并且确保样品已匀浆充分。 2.3 实验试剂与仪器 2.3.1主要试剂 骨桥蛋白（OPN）、人白细胞介素-18（IL-18）、人白细胞介素-12（IL-12）酶联免疫分析（ELISA）；上海裕平生物科技有限公司。 2.3.2实验仪器 （1）全自动生化分析仪：日立7600，日本。 （2）TDZS-WS低速多管架自动平衡离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。 （3）全自动酶标免疫分析仪：意大利希亚克全自动酶免分析仪。 （4）37℃恒温箱：日本三洋公司。 （5）酶标仪：型号MK2，芬兰。 （6）800型普通离心机：上海器械十厂。 （7）微量移液器：德国。 （8）普通冰箱：海尔BCD-268。 （9）-75℃冰箱：日本三洋公司。 2.4细胞因子检测 2.4.1 骨桥蛋白（OPN） 2.4.1.1 骨桥蛋白试剂盒组成 (1)标准品（g/L）0.5ml；(2)30倍浓缩洗涤液ml；(3) ml；(4) ml；(5) ；(6)酶标包被板12孔8条 ；(7) 终止液6ml；(8) 显色剂B液6ml；(9)显色剂A液6m；(1) 封板膜2张11)密封袋1个。 (1)使用ELISA试剂盒从取出室温酶标包被板用完板条应装入密封袋保存。 (2)(3)在各步骤经常校对准确性。(4) 手中的吸头和封板膜应避免重复使用避免交叉污染影响实验数据。 (5)不同的批号的试剂不要，所有试剂保质期内使用。 (6)底物避免暴露于下开启后应尽快完成实验对光(7)每次测定时应做标准曲线，最好做复孔。 (8)各步骤均应严格按照说明书进行(1)因为NaN3可抑制辣根过氧化物酶的活性不能检测含NaN3的样品。 (2)标本采集后尽快进行实验马上进行可将标本放于-20保存避免反复溶(1)标准品的稀释：μl，之后再加50μl标准品稀释液与第一、第二孔中，使其混匀；然后再从第一、第二孔中各取100μl后分别加入到第三、第四孔中，再将50μl标准品稀释液分别加入至第三、第四孔中后混均匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再从第三、第四孔中各取50μl分别加到第五、第六孔之中，再在第五、第六孔中分别加50μl标准品稀释液，混均匀；以此类推然后从第五、第六孔中分别取50μl后加入到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加50μl标准品稀释液，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加入至第九、第十孔中，再在第九、第十孔中分别加50μl标准品稀释液，混匀后从第九、第十孔中分别各取50μ