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定序上常見之trouble shooting~ Too much template DNA Too little DNA template Chemical contaminant DNA contamination 定序上常見之trouble shooting~ * * PART I Sample preparation: Signal intensity: G(13694), A(13557), T(12394), C(11252) 原因:在PCR過程中,template 濃度過高所造成 特徵:分析軟體顯示一般 G intensity皆大於 (10000)以上 Eletrophorgram 之圖示會有很強之background 影響到major band之判讀 解決方式:直接將上機之樣品重新以 HiDi formamide 稀釋後再重跑即可 Too much template DNA Ave signal intensity:G(101),A(69),T(76),C(71) 原因:在PCR過程中,template 濃度過低所造成 特徵:分析軟體顯示一般 G intensity皆小於 (300)以下 Eletrophorgram 之圖示會發現序列讀到600bps後因 DNA 不足導致 background會拉高且序列讀不長 解決方式:重新再一次 PCR,增加反應中 DNA 的 template Too little DNA template Signal intensity: G(427), A(302), T(216), C(247) 原因:在 PCR 過程中,因樣品本身製備過程不當或是遭到污染 例如:鹽類,蛋白質,清潔劑或是其他抑制劑污染，進而影響到PCR的過程 特徵: Eletrophorgram 之圖示會有很強之background 影響到 major band 之判讀 且序列通常都讀不長 解決方式:直接將樣品重新純化後再重新做定序反應 Chemical contaminant 處理前 處理後 原因:在點菌過程中挑菌污染,挑到two clone 特徵:Eletrophorgram 之圖示會發現一般前60-70bps序列是非常sharp 但是之後的序列會有很強的兩個peak 重疊且訊號也不低 解決方式:重新挑菌抽 plasmid 定序 DNA contamination PART II 定序報告常見之Eletrophogram~ No signal Signal noise Excess dye peaks Secondary structure N-1, N-2, N-3... Priming Sequencing Trace 原因:(1) PCR反應失誤 (2) Clone失敗 (3) primer 錯誤 特徵:Eletrophorgram 之圖示無訊號 (No signal) 解決方式(1)重新做定序反應排除人為失誤因素 (2)建議重新clone Signal intensity: G(32), A(37), T(40), C(34) No signal Signal noise Signal intensity: G(44), A(46), T(49), C(48) 原因:(1)PCR反應過程中DNA濃度不足 (2)PCR反應人為操作失誤 (3)primer合成效率不佳 = (PCR過程中primer Tm 過低) = (primer 品質變差) (4)DNA 品質不佳(degraded) 特徵:Eletrophorgram 之圖示會發現訊號微弱 且雜亂,定序讀不長 signal intensity lower，導致 free big dye 殘留 解決方式: (1)重新反應調整DNA濃度並排除人為 操作失誤 (2)check primer quality and Tm值 調整PCR annealing Tm (3)Run Gel check DNA quality 重新純化或製備樣品 Noise data through sequence, with good signal strength 原因:multiple pr