高分辨溶解(HRM)分析解析.ppt

第二课 高分辨溶解（HRM）分析 hnxide@163.com 高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面 一、原理 PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。 双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是SYBR? Green I。 但是当时这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。如果要区分SNP，分辨率还不够。 饱和染料和非饱和染料 非饱和染料 对PCR有抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降 饱和染料 对PCR没有影响，高浓度的染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。目前市场上的饱和染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等几种 HRM分析仪 目前市场上有多个厂家提供HRM分析的仪器，包括Idaho Technology、Corbett（QIAGEN）、Roche等，有些是专供HRM的仪器，有些则是附带HRM功能的定量PCR仪 HRM的发明者—美国犹他大学医学院的Wittwer实验室曾评估了市场上多台仪器在基因分型和突变扫描上的性能。他们发现，对于大部分仪器的准确基因分型来说，主要限制在于平板上的空间温度差异（Tm的标准偏差为0.020-0.264°C）。其它差异如数据密度、信噪比和熔解速率，也会影响杂合体的扫描。经过比较发现，空气加热型仪器以及样品温度单独控制的仪器有着更低的Tm标准偏差（0.018-0.065），而加热块型仪器则在0.092-0.274。 HR-1 HR-1仪器是美国Idaho公司采用精确温度控制技术，并结合高速的数据采集技术，配合使用高分辨的饱和LC Green荧光染料，使该仪器具有较高的灵敏度和特异性。分析时不消耗被测PCR产物样品，分析结束后PCR产物可用于下游的分析，如测序等。 HR-1特点： ?? 升温速率： 0.01 ℃ -1 ℃ / 秒 ?? 数据采集密度： 100 个数据 / ℃?? 使用 LC Green 荧光染料?? 反应体系 5-20ul ?? 分析时间： 40-45 样品 / 小时（基于 0.3 ℃ / 秒升温速率） HRM 的应用领域 1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） ? 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） ? 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的扫描，新突变的发现。 3 ） ? 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） ? 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） ? 动植物品质相关多态性位点的研究等。 2、HLA(人类白细胞抗原 ) 基因组配型  器官移植的 HLA 配型、同胞之间 HLA 基因型确定，如快速确定 HLA 高度多态性位点的类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的 HLA 基因型确认 。 3 、等位基因频率分析 4 、物种鉴定、品种鉴定 1 ） ?