第二章基因工程的工具酶2解决方案.ppt

第二章 基因工程的载体和工具酶 2.4 基因工程工具酶 1.工具酶的概念 应用与基因工程的各种酶的总称. 切: 连: 修饰: 3. DNA聚合酶 (1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)： 具有三种酶活性 a、5’ ---3’DNA聚合酶活性 CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+ dNTP GGCTATCGGA b、3’ ---5’ 外切酶活性 CGCATCG-OH E.coli DNA pol I CGC ATCG GCG Mg2+ dNTP GCG c、5’ ---3’外切酶活性 CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAG GCGTAATC Mg2+ GCGTAATC (2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’ --3’外切酶活性 Klenow酶的基本用途： a.补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端 b.DNA片段的同位素末端标记 c.cDNA第二链的合成 d.双脱氧末端终止法测定DNA序列 4. DNA连接酶 连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。 (1). T4噬菌体DNA连接酶 不受dNTP的抑制，催化DNA片断的连接。 (2). E.coli DNA连接酶 不能连接平端DNA,不能连接RNA。 5. 碱性磷酸酶 去除DNA或者RNA的5‘’磷酸，可防止自身环化。 5’pDNA 5’OHDNA 5’pRNA 5’OHRNA 6.末端转移酶 分子量60000D,在二价阳离子的作用下，催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端。 底物： 带3’羟基端单链DNA或带3’羟基突出端的双链DNA。 7.核酸酶S1 S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） 水解单链核酸以及双链核酸中的单链区或单链末端，产生5’–核苷酸和5’末端为p的寡核苷酸。 Zn2+必需,最适pH范围为4.0 - 4.3,需要NaCl 10 - 300 mM. 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 8 .T4噬菌体多核苷酸激酶 催化ATP的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA的5’末端。 用途： 1 .标记DNA5’末端。 2.对缺乏5’磷酸基团的DNA进行磷酸化或者合成接头进行磷酸化。