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二 简答题 1、何为酶工程？试述其主要内容和任务。P1 答、酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程? 酶工程的内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子的修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。? 酶工程的任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。 2、何为酶微生物合成的诱导作用？利用操纵子学说简述其原理。P30 答、加入某些物质使酶生物合成开始或加速进行的现象，称之为诱导作用。? 原理：加入与酶催化作用的底物或其类似物的诱导物，使其与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白结构发生改变，从而使其与操纵基因的结合力减弱，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，就使RNA聚合酶可以与启动基因结合，进行转录而合成结构基因所对应的酶。 3、何为酶生物合成的反馈阻遏作用？利用操纵子学说简述其原理。P31 又称产物阻遏作用，指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。引起反馈阻遏作用的物质称为阻遏物，阻遏物一般是酶催化反应的产物或是代谢途径的末端产物。原理：当环境中色氨酸浓度增加，阻遏物达到一定程度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其结构发生改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因的结合力增强。阻遏蛋白与操纵基因结合，就排挤RNA聚合物与启动基因的结合，使转录无法进行，酶的生物合成因此受到阻遏。指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。原理：某些物质经过分解放出能量，有一部分能量储存在ATP中。ATP是由AMP和ADP通过磷酸化作用产生的。细胞内的ATP浓度增加，ADP浓度降低，存在于细胞内的cAMP就通过磷酸二酯酶的作用水解生成AMP。同时腺苷酸环化酶的活化受到抑制而使cAMP 的生成受阻，从而导致细胞内cAMP的浓度降低。这就必然使cAMP-CAP的复合物浓度降低，结果启动基因的相应位点上没有足够的cAMP-CAP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到其在启动基因的相应位点上，转录无法进行，酶的生物合成收到阻遏。解除方法：分解代谢物阻遏作用以及该阻遏作用的解除，实质上是cAMP通过启动基因对酶生物合成进行调节控制。在培养环境中控制好某些降解物质的量，或在必要时添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。 12、差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心的区别？P82 ? 密度梯度离心 等密度梯度离心 差速离心 梯度介质 通常用蔗糖 最大的梯度密度最小密度的沉降样品 通常用CsCl 最大的梯度密度密度最大的沉降样品 普通缓冲液 离心条件 在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度 使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离 分离依据 密度相近，但沉降系数不同 沉降系数相近，但密度不同 大小和密度差异较大，沉降速率不同 总结： 等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。 差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。 密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液 13、什么是凝胶过滤层析，凝胶过滤层析有哪四方面的应用？P95 又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 ?应用：⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。 用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。 测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。 高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液 22、简述易错PCR与常规PCR技术的异同点。P159 同：基本过程相同，包括双链DNA变性、引物与单链DNA结合、引物延伸三个步骤 异：反应条件不同 在易错PCR中Mg2＋浓度较高，以稳定非互补的碱基对 在易错PC