颈椎后纵韧带胶原、蛋白多糖、钙含量变化的研究.docVIP

颈椎后纵韧带胶原、蛋白多糖、钙含量变化的研究 【摘要】 ［目的］通过定量测定颈椎后纵韧带总胶原、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和钙含量改变，探讨颈椎后纵韧带在颈椎病发病机理中的意义。［方法］收集脊髓型颈椎病下位颈椎后纵韧带15例作试验组，同年龄段正常下位颈椎后纵韧带10例作对照，Weossner法测定两组总胶原含量；酶联免疫吸附法测定Ⅰ型、Ⅱ型胶原含量；间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量；甲基百里香酚蓝比色法测定钙含量；进行HE染色和Masson染色，对比观察后纵韧带的显微结构变化特点。［结果］试验组总胶原、Ⅰ型胶原和蛋白多糖含量低于对照组；试验组Ⅱ型胶原含量较对照组高；试验组Ⅰ型/Ⅱ型胶原比值低于对照组；试验组钙含量较对照组高，组间对比均有统计学意义（P＜0.05）；病理结构显示试验组弹力纤维、胶原纤维肿胀，排列紊乱。［结论］颈椎病患者颈椎后纵韧带退变，总胶原、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和钙代谢发生紊乱，颈椎后纵韧带分子水平的生物化学变化与颈椎病发生发展有密切关系。 【关键词】 颈椎病； 后纵韧带； 胶原； 蛋白多糖； 钙化 　　颈椎病是以颈椎间盘退变为主要病变基础，导致颈周围肌肉、关节继发性改变和相邻椎体退变增生而直接压迫神经血管所诱发与之相关的临床症状和体征的疾病。后纵韧带退变在颈椎病的发病因素中，占重要地位〔1、2〕。大量的研究表明颈椎后纵韧带退变与基因、环境等多种因素有关。目前国内外对椎间盘及黄韧带的生物化学水平微量变化进行了大量的研究，但对颈椎后纵韧带胶原和蛋白多糖等物质生物化学水平定量变化的相关研究鲜见〔3〕。 　　本实验通过定量测定实验组和对照组总胶原、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和钙含量变化，同时对比观察两组显微病理变化，为颈椎后纵韧带退变提供分子生物化学量化依据，并探讨颈椎后纵韧带在颈椎病发病机理中的意义。 　　1 材料和方法 　　1.1 病例选择 病例组选取本院2005年10月～2006年5月收治病人中的15例脊髓型颈椎病手术患者的C4、5或C5、6节段颈椎后纵韧带，并去除明显骨化块部分，其中男9例，女6例；年龄47岁～63岁，平均年龄54岁，颈椎病均根据临床症状、体征及常规X线、MRI检查明确诊断；对照组由东南大学解剖教研室提供，为同年龄段10例生前无糖尿病史、颈肩痛病史、家族性颈椎病史尸体，C4、5和C5、6颈椎后纵韧带作对照，其中男6例，女4例；年龄45～60岁，平均52岁，在死亡后12 h内取材。标本取得后，用生理盐水冲洗，吸水纸吸干表面的水分，铝锡纸密封放入-80 ℃冰箱储存备用。 　　1.2 主要试剂和仪器 标准羟脯氨酸（Sigma,USA）；酶标器（Bio Red，USA）；Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶联免疫测定试剂盒（TPI Inc，USA）；甲基百里香酚蓝比色法钙测定试剂盒（南京建成生物技术有限公司，中国）；Masson三色试剂盒（福建迈新生物技术开发公司，中国）。 　　1.3 Woessner方法测定羟脯氨酸 标本脱水、脱脂、烘干、称重，加100倍于样本量6 mol/L盐酸在110 ℃分解24 h，旋转蒸发器去除盐酸，双蒸水溶解残留物，加氯胺T溶液室温静置20 min，加过氯酸溶液室温静置5 min，加对苯胺基苯甲醛溶液在60 ℃温箱20 min，取出待冷却，在波长560 nm处测定吸光值。通过羟脯氨酸标准曲线计算出待测液内的羟脯氨酸浓度，以此推算组织总胶原蛋白含量。 　　1.4 ELISA测定Ⅱ型胶原的含量 标本称重，脱水脱脂，0.4 mol乙酸浸泡过夜，在冰浴下制备成匀浆，以盐析法提取胶原。酶联免疫吸附法（ELISA）测定Ⅱ型胶原，按试剂盒说明书的步骤进行，在波长450 nm下测定Ⅱ型胶原的浓度，计算含量。 　　1.5 蛋白多糖含量测定方法 采用间苯三酚分光光度法〔4〕，测定光密度值，转换为量值作蛋白多糖含量的测定。 　　1.6 钙含量测定 标本烘干称重，研磨成粉末，浓盐酸高温分解，蒸发盐酸，双蒸水溶解残留物，按说明书进行甲基百里香酚蓝比色法测定钙离子含量。 　　1.7 组织病理学观察 标本用10％福尔马林浸泡过夜，脱水、透明、浸蜡、切片，Masson染色，光镜观察。 　　1.8 统计方法 用SPSS 13.0统计软件包对总胶原、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和钙比值的数据进行分析，结果以x-±s表示，组间差异比较应用两组均数的t检验。P＜0.05表示差异有意义。 　　2 结果 　　2.1 标本大体观察 试验组后纵韧带质地变硬，弹性减低，色泽发白，有时可触及质地硬的骨化块。对照组后纵韧带质地柔软，富有弹性，有光泽，湿润。 　　2.2 Woessner方法测定羟脯氨酸结果（表1）