苦参碱对大鼠原代培养皮质神经元gabar蛋白表达的影响-.docVIP

苦参碱对大鼠原代培养皮质神经元GABAR蛋白表达的影响* 【摘要】 目的 观察苦参碱对大鼠原代培养皮质神经元γ-氨基丁酸受体（GABAR）蛋白表达的影响，探讨苦参碱抑制中枢的作用机制。方法 对Wistar新生大鼠原代培养皮质神经元分别给予剂量为0.5、1.0、2.0mmol/L培养基的苦参碱进行药物干预，4h后用细胞免疫组化方法测定GABAR的蛋白表达。结果 与阴性对照组相比，各给药组神经元GABAR蛋白表达均显著增加（Plt;0.05）。结论 苦参碱使GABAR蛋白表达增强。 【关键词】 苦参碱;神经元；γ-氨基丁酸受体 【Abstract】 Objective To study the mechanism of the inbitory effect of matrine on central nervous. Methods In the present study, incubation of postnatal Wistar rat cortex neurons in culture with matrine at 0.5, 1.0, 2.0mmol/L (medium) was carried out to have knowledge of the effect of matrine on the expressions of GABAR. Results Immunocytochemistry showed a significant up-regulation of GABAR after 4 hours of matrine treatment compared with the control (Plt;0.05). Conclusion The results demonstrate that matrine can increase the expression of GABAR. 【Key words】 matrine;neuron; GABAR(γ-aminobutyric acid receptor) 苦参碱（matrine，Mat）是豆科植物苦参、苦豆子、广豆根等中草药的活性成分，是苦参碱类生物碱的代表。现已发现Mat具有中枢抑制作用［1~3］，但其作用机制少有报道。本文通过观察Mat对神经元抑制性受体γ—氨基丁酸受体（GABAR）的蛋白表达量的影响，探讨Mat的中枢抑制作用机制。 1 材料与方法 1.1 药品 苦参碱由宁夏紫金花药业提供。 1.2 主要实验试剂和仪器 细胞培养基DMEM（Gibco），胎牛血清和胰蛋白酶（Hyclone），卵清蛋白和DAB（Sigma）， N-2 Supplement(Gibco)。CO2培养箱（NAPCO），IX70倒置显微镜（Olympus），图像分析系统(Image-Pro plus 4.0)。 1.3 分离式原代神经元培养 1.3.1 神经胶质细胞滋养层培养 取新生Wistar大鼠，取大脑皮质。机械吹打，调节细胞悬液浓度为3×105/ml，置于孵箱中培养。2周后，胶质细胞呈亚融合状态，制备成胶质细胞滋养层。 1.3.2 原代神经元培养 取新生Wistar大鼠，取大脑半球，胰酶消化，接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，调整细基础学院药理教研室胞数为3×103/片。静置，待细胞贴壁，将载有细胞的盖玻片移入上述胶质细胞滋养层培养皿中。接种后第2天加阿糖胞苷抑制胶质细胞生长。 1.4 分组及给药 神经元培养第6天随机分为4组，分别给予含有0、0.5、1.0、2.0mmol/L培养基的Mat溶液。 1.5 细胞免疫组化法观察Mat对γ-氨基丁酸受体（GABAR）蛋白表达的影响 取出载有神经元的盖玻片，4%多聚甲醛冰上固定30min。血清封闭30min后，GABAR一抗（1：200）4℃过夜，生物素标记二抗（1：200）室温2h，辣根酶标记链亲合素（1：200）室温1h，DAB显色。系列浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片。 1.6 光密度分析 每个剂量组随机观察150个细胞，利用图像分析系统（Image-Pro Plus 4.0）采集图片，进行光密度分析。以光密度值为计量资料，用SPSS11.0软件包对数据进行t检验。 2 结果与分析 原代培养至第6天，神经元发育成熟，胞体饱满，神经元间形成网络连接。免疫组织化学实验后，神经元仍保持了形态上的完整，为定量分析提供了保证（图1、2）。苦参碱对GABAR蛋白表达的影响见图3。从图1、2、3可以看出，与阴性对照组相比，Mat各剂量组GABAR蛋白表达均明显增强(Plt;0.05)，并有剂量依赖趋势。注：与