细胞实验MTT.docxVIP

细胞生物学实验 利用MTT比色法测定细胞群体的相对细胞数量 一、实验目的 1.熟悉掌握细胞传代培养2.学习和掌握细胞生长速率的测定3.学会用MTT法检测细胞的生长状况4.了解MTT法在生物学研究中的应用二、实验原理细胞生长曲线是观测细胞在一代生长期内增殖过程的重要指标，为培养细胞的细胞生物学参数之一。 图一：体外培养细胞的一代生长曲线MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内(OD值在0.7以内)，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。【注】MTT比色法的影响因素1.溶剂溶解甲瓒能力不同；2.培养基中的酚红、血清和PH变化可能影响OD值；3.DMSO溶解能力强，但是可能与残留MTT发生反应，随着时间延长不断加深。（改良方案：SDS+DMSO）；三、实验材料1.实验仪器：超净工作台，CO2 培养箱，荧光显微镜2.实验材料：HeLa细胞，96孔板3.实验试剂：PBS(Ph=7.4)，MTT母液(5mg/mL,溶于PBS)，裂解液（10%SDS-0.01N HCL于室温保存），胰酶，DMEM培养基，血清四、实验步骤1.取生长期的HeLa细胞，用胰酶消化计数，配制细胞悬液浓度为8×104/mL；2.每列都加完全培养基100μL（除去第二列），取细胞悬液200μL接种到第二列，在第二列取100μL接种到第三列，依次类推；最终的细胞浓度见下表；3.检测：弃去旧培养基，加入100μL含MTT的培养基（5mg/mL MTT:培养基=1:10）；4.孵育4hr，然后加100μL裂解液过夜；5.用酶标仪测OD值，检测波长为570nm；表一：96孔板设计（溶液为200μL）123456A无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释B无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释C无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释D无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释E无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释F无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释G无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释H无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释【注】第7至11列与第2至6列相同，第12列与第1列相同；五、实验结果及分析实验结果：表二：实验组1 OD值结果123456A-0.0940.1130.0470.2410.033-0.030B-0.0960.1660.0240.3190.1740.111C-0.0870.2880.0250.3060.1920.096D-0.0970.4590.4070.3440.1830.143E-0.0740.5310.0570.3430.1840.163F-0.0740.3860.0000.3960.1910.126G-0.0920.3410.0470.2890.127-0.015H-0.0500.0300.0310.2980.162-0.138平均值-0.0830.2890.0800.3170.1560.057表三：实验组2OD值结果789101112A0.1660.114-0.0270.056-0.059-0.063B0.3280.7950.0200.018-0.0060.057C0.7190.3360.0210.0550.0020.044D-0.0750.4210.0780.0650.0130.038E0.5350.9480.3010.0320.024-0.046F0.7940.1200.062-0.026-0.025-0.016G0.1260.1280.002-0.060-0.042-0.035H0.358-0.044-0.041-0.072-0.049-0.648平均值0.3690.3520.0520.009-0.018-0.083图一：实验组1的OD平均值曲线图图二：实验组2的OD平均值曲线图结果分析：由图一可以得出我们小组的实验组1的结果并不理想；实验最后测得OD值没有规律，较乱；而且在未加入裂解液