第八章酶定向进化讲解.ppt

*/169 */169 第四节 酶分子定向进化的应用 */169 酶分子定向进化的应用 酶分子定向进化的特点： 适应面广：P酶、R酶 目的性强：人工控制条件筛选 效果显著：能在短时间内获得自然界需要长时间完成的进化。 */169 一些酶定向进化结果 目标酶 所需功能 方法 结果 实施菌种 卡那霉素核苷基转移酶 热稳定性 定位诱变+选择 在60-50℃酶半衰期增加200倍 耐热脂肪芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶 作用于有机溶剂 易错PCR+选择 在60％二甲基亚砜中活力增强170倍 枯草杆菌 β-内酰胺酶 作用于新底物 DNA改组+选择 对cefotaxime的抗性增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶 有机溶剂中的底物特异性和活性 易错PCR+重组 活力增加60-150倍 大肠杆菌 胸苷激酶 第五特异性 基因理疗 交错延伸+选择 活力增加43倍 大肠杆菌 β-半乳糖苷酶 底物特异性 DNA改组+选择 活力增加66倍底物特异性增加1000倍 大肠杆菌 砷酸脱毒途径 砷酸抗性 DNA改组+选择 抗性增加12倍 大肠杆菌 */169 一、提高酶的催化活性 是定向进化的主要目标之一 例如： 1993年陈等人提高枯草杆菌蛋白酶E在有机溶剂中的催化效率（157倍） 1994年Stermer使β-内酰胺酶催化活性提高32000倍 1992年Beaudry等使四膜虫RNA剪切酶提高100倍 */169 二、增强酶的稳定性 提高酶稳定性的方法： 分子修饰 固定化 非水相介质催化 定向进化 */169 枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 最适温度提高17℃，65℃的半衰期延长50-200倍 */169 三、改变酶的底物特异性 影响酶对底物的Km值，进而改变底物特异性。例如 2000年，Aharoni等采用基因家族重排技术将大肠杆菌碱性磷酸酶对有机磷酸酯的特异性提高2000倍 2005年，冯志勇等采用易错PCR技术使β-糖苷酶失去原有的催化糖苷水解的活性，而呈现糖基转移酶的活性 2002年，Bartel使RNA剪切酶失去催化RNA分子剪切反应的特性，而呈现出将RNA和多肽链拼接在一起的催化特性。 */169 * 自然突变需要经历一个漫长的过程，突变后的性状，按照“适者生存、不适者淘汰”的自然筛选法则也需要几万年、几百万年甚至更长的筛选过程。 在某种意义上来说，进化是一门难以用实验重演或最终证明的科学 * Figure 2. Diagram of DNA shuffling. First, the parental sequences are randomly fragmented by the enzyme DNase I. The fragments are then reassembled by repeated primerless PCR cycles. Each cycle consists of (i) denaturization, when double strands of DNA are separated into single strands, (ii) annealing, when DNA fragments reanneal forming duplexes and (iii) extension, when the addition of new nucleotides is catalyzed by a polymerase enzyme. Crossovers are generated during the extension step when duplexes composed of fragments from different parents have new nucleotides added. After many cycles, full-length sequences are reassembled.  Figure 1.?M13 phage as used in phage-displayed libraries and as templates for nanoscale materials.?(a)Schematic of M13 phage with phage DNA modified to display a protein or peptide as a fusion to the coat protein pIII. Only genes III and VIII of the phage DNA are shown as these are the most utilized for display purposes and in the selection