高效液相色谱法简介案例.ppt

流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂有己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 选择流动相时应注意的几个问题 （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 第五节 图形结果分析及其应用 色谱图(Chromatogram) : 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间 ←色谱峰 时间(分) 基线 ↓ 峰高 峰宽 响应值 色谱数据处理 分离柱 检测器 记录仪 积分仪 色谱工作站 色谱仪信号输出方框图 色谱数据处理通过ADC转换器, 把模拟信号转换成数字信号, 然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。 数据处理原理： ◆ 峰的检测 ◆ 数据采集 ◆ 基线校正和重叠峰的分离 自动处理 人工修正 ● 峰的检测 峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个“阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化： 切线 色谱峰的判断 最小面积 ▲依照信号斜率的变化检测信号 ▲依照积分面积检测峰信号 ???? 保留时间和峰面积的计算 ● 基线校正和重叠峰的分离 在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂移值参数来解决 色谱仪自动定性和定量分析 ◆ “时间窗”法 (Time Window)：tR±Δt 对整个色谱图上各个峰的保留值都设定相同区间“时间窗” ，规定图中各个峰保留时间的变化范围。该法设置简单，但用于识别保留时间相差很近的相邻峰不大方便。 ◆ “时间带”法 (Time Band): tR(1±a%) 对每个需识别的定量峰，都设定一个保留时间的相对变动范围。该设置较麻烦，但对不同峰可给出不同的变动范围，对识别相邻峰的分辨率较好，同时用于编组定量分析也很方便。 高效液相色谱的定性和定量分析 1.定性分析 在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（t R′或V R ′ ）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。 2.定量分析 基本方法有内标法、外标法等。 外标法———标准曲线法 是一种简便、快速的绝对定量方法（归一化法则是相对定量方法）。首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。 具体作法是： 用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。 实验仪器的基本操作 1、 开机，启动装置，进入Win2000；开启LC，点击Instrumentl online图标，进入仪器控制面板，设置所需各项参数。 2、 设置分析用流动相清洗流路,等待色谱柱、系统的平衡，基线稳定，开始进样分析。 3、 分析结束，数据处理，打印报告。 4、 关闭柱温箱和检测器，冲洗色谱柱，关闭脱气机、泵，关闭整个装置。 5、 关闭总电源。 6、 在记录本上记录使用情况。 高效液相色谱的应用 高效液相色谱法被广泛应用于分离、分析高沸点物质，热稳定性差物质，生理活性以及大分子物质 一、样品测定 1．流动相比例调整：建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。 2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。 3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱