核酸的分离纯化案例.ppt

核酸的分离与纯化 分离纯化核酸总的原则 : 1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸结构和功能的基础； 减少化学、物理、生物因素对核酸的降解： 避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏； 避免机械剪切力以及高温煮沸； 抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染，保证核酸样品的纯度。 核酸分离提取的基本步骤 细胞的裂解 物理法：煮沸、冻融、微波、超声波、匀浆、液氮研磨等，这些物理操作可能导致DNA链的断裂。 化学法：高盐、表面活性剂SDS、热酚法等。 酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等，此方法较为温和，可获得大分子量的DNA。 核酸的纯化 杂质主要包括三部分： ①蛋白质等大分子污染物； ②其它核酸分子； ③分离纯化过程中加入的对后续实验有影响的溶液和试剂。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 一般采用方法是：酚/氯仿抽提。 其原理：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质的效果。因为酚虽然可有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制DNase的活性。氯仿能加速有机相与液相分层。在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。最后用氯仿抽提是为了去除核酸溶液中的痕量酚。 核酸的沉淀、浓缩 沉淀是浓缩核酸最常用的方法 优点 ①改变核酸的溶解缓冲液种类； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。 沉淀核酸常用的盐和有机溶剂 盐类： NaAc、 KAc、 NH4Ac NaCl 、 KCl、 MgCl2 有机溶剂： 乙醇、异丙醇、聚乙二醇 核酸的保存 DNA DNA样品溶于pH8.0的TE缓冲液，-20 ℃或-70℃保存； RNA ① RNA样品溶于三蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可溶于0.1%DEPC水中。 *TE缓冲液(pH8.0)： Tris-EDTA buffer(100mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L EDTA pH8.0) *DEPC水： 焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理的水。 注意事项 材料新鲜。尽量简化操作步骤，缩短提取时间，减少有害因素对核酸的破坏； 减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸，过碱对磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行； 减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力和高温。0~4℃的温度环境降低核酸酶的活性与反应速率，减少对核酸的生物降解； 防止核酸的生物降解，主要是指细胞内、外的各种核酸酶。如DNase需要金属二价离子Mg++，Ca++的激活，使用金属二价离子螯合剂EDTA柠檬酸盐，基本可以抑制DNase活性。 核酸的鉴定 紫外分光光度法 原理：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，最大吸收波长为260nm，利用这一特性可定量溶液中的核酸浓度。 结论： 1.000A 260nm = 50μg/ml ds-DNA 1.000A 260nm = 40μg/ml ss-RNA 1.000A 260nm = 33μg/ml ss-DNA 紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤 1.吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后（3ml），转入分光光度计的石英比色杯中。 2.分光光度计先用一定量的水校正零点。 3.测定待测样品在260nm和280nm的吸光度值。 4.计算浓度。 ds-DNA (μg/μl) = A260×核酸稀释倍数×50/1000 ss-RNA (μg/μl) = A260×核酸稀释倍数×40/1000 5.分析纯度。 测定结果分析 1、测DNA：纯的DNA样品A260/A280应为1.8 1) A260/A280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。 2、测RNA：纯的RNA样品其A260／A280应介于1.8~2.0之间 1）若RNA样品A260/A280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； 溴乙锭荧光法 原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。该法灵敏度可达1~5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。 溶胀：双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核。 破核膜：STE裂解液、SDS、蛋白酶K等破坏核膜，使蛋白质变性并降解，核蛋白体被破坏。 抽提：酚/氯