病原生物学实验课2-肠道病原菌的分离与鉴定1.ppt.pptVIP

肠道病原菌的分离与鉴定一 培养基的制备及常用培养基 细菌的培养法 EMB培养基的制备 肠道病原菌的分离与鉴定（一） 血清学检测-肥达氏反应 培养基的制备 (一)肉汤培养基 材料：鲜牛肉、蛋白胨、氯化钠、pH试纸、10％碳酸氢钠、试管、三角烧瓶、蒸馏水等。 方法 1．将新鲜牛肉500g切碎或搅碎，加水1000ml，放4℃冰箱或冷处浸泡过夜，然后煮沸30min，放凉，使残余的脂肪凝固，再用绒布或滤纸过滤，将滤液补足为原量。 2．1000ml肉水中加入蛋白胨10g、氯化钠5g，加热溶解。 3．用精密pH试纸测酸碱度，用10％碳酸氢钠校正pH为7.2左右。过碱时，可用10％醋酸校正之。 4．分装于试管中或三角烧瓶中，15磅(121℃)高压蒸气灭菌20～30min。 (二)普通琼脂培养基 材料：肉水、蛋白胨、氯化钠、琼脂、无菌平皿、灭菌试管、三角烧瓶等。 方法 1．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧瓶中，加热溶化。 2．用pH试纸测酸碱度，用10％碳酸氢钠校正pH为7.2左右。 3．15磅高压蒸气灭菌20～30min。 4．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内，每个平皿倒入约15ml，凝固后即成普通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒入灭菌试管内，再将试管斜放试验台上，凝固后即成普通琼脂斜面培养基。 (三)血液琼脂培养基 有些细菌其营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良，可用血液琼脂培养基进行培养。 材料 ① 普通琼脂培养基 ② 血液(脱纤维羊血或兔血) 方法 1．加热溶化普通琼脂培养基。 2．待冷至50℃左右时，加入无菌的脱纤维血液，混匀(注意勿使产生泡沫)。 3．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基。 E.M.B琼脂培养基的制备 成分 蛋白胨 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20g 乳糖溶液(20％) 50ml 伊红溶液(2％) 20ml 美蓝溶液(0.5％) 20ml 蒸馏水 1000ml 制法 ①将蛋白胨和磷酸氢二钾加温溶化于蒸馏水中 ②校正pH值为7.6加入琼脂 ③煮沸溶化过滤后分装三角瓶中，每瓶定量分装 ④15磅30min高压灭菌 ⑤以无菌操作法按量加入经10磅20min高压灭菌的乳糖、伊红美兰液，混匀后倾注平皿备用。 E.M.B培养基 原理 大肠杆菌能分解乳糖产酸，使培养基pH值下降，伊红与美蓝相结合成一种复合物，酸性环境中，菌体带正电，易与伊红结合，故菌落呈紫黑色或紫红色，并有金属光泽。碱性环境中伊红与美蓝不结合，病原菌不分解乳糖，不产酸故菌落为无色半透明。其次，伊红、美蓝有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。 用途 用于分离肠道致病菌，是一种鉴别培养基。并有弱的选择作用。 肥达氏反应 肥达氏反应通常用已知的伤寒杆菌“O”、“H”菌液和甲、乙型副伤寒杆菌“H”菌液与病人血清作定量凝集试验(试管法)，以检测病人血清中有无相应抗体存在，根据抗体含量多少及增长情况用于伤寒、副伤寒病的辅助诊断。 材料 ①待检可疑伤寒病人血清(1:10稀释) ②诊断菌液：伤寒杆菌“O” (O) 伤寒杆菌“H” (OH) 甲型副伤寒杆菌“H” (PA) 乙型副伤寒杆菌“H” (PB) ③生理盐水 ④吸管，小试管等。 方法 本实验四人一组，每人取6只小试管，排成一列，计四列为一完整试验。分别标明每列管号和诊断菌液如“O”、“OH”、“PA”、“PB”。按下表先向每管加生理盐水0.5ml，再加10倍稀释病人血清0.5ml于第l管，做顺序的等倍稀释，最后加入等量的诊断菌液，充分混匀，置37℃ 2~4h，再放室温24小时后观察结果。 * * 高压蒸汽灭菌器 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 诊断菌液（ml） 0.5→ 弃去 0.5↘ 0.5↘ 0.5↘ 0.5↘ 0.5↘ 病理血清10X（ml） 0.5 0.5 0.