生物药物分析与检验酶分析法__培训课件.ppt

Q10（温度系数）：反应温度提高10℃，其反应速率与原来反应速率之比，对大多数酶来讲，温度系数Q10多为2， * 测定酶活力就是测定产物增加量或底物减少量，主要根据产物或底物的物理或化学特性来决定具体酶促反应的测定方法， 同位素测定方法 电化学法 * 乳酸脱氢酶(LDH) 、谷草转氨酶(GOT )、苹果酸脱氢酶（MDH） * HK 已糖激酶 * K为正反应的速度常数 * S 已糖 * 101页 * 甘油激酶（GK）， 丙酮酸激酶（PK） * 华勃氏微量呼吸仪（瓦氏呼吸仪） 五 电化学法（electrochemical） pH测定法：用高灵敏度的pH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用pH的变化来测定酶的反应速率。 离子选择电极法：测定某些酶的酶活力，用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应，如葡糖氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。 第二节 酶法分析 一、终点测定法 二、反应速度法 一、原理 是在以待测物质为底物的酶反应中，如果能使底物能够接近完全地转化为产物，而且底物或产物又具有某种特征性质，通过直接测定转化前后底物的减少量，产物的增加量或辅酶的变化就可以定量待测物——平衡法 用于复杂组分中结构或物理化学性质比较 相近的同类物质的分离鉴定和分析。 特异性强、干扰少、操作简单、样品和试 剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特 点。 通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能 发生的干扰反应并设法纠正。 可用偶联反应。 无污染或污染很少的分析方法。 优 点 ： 一、终点测定法 1.原理：先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成的偶数酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量。 2.一般采用的测定方法： ①光吸收、荧光之类的分光光度法 ②测定气体产生与吸收的测压量气法（华勃氏呼吸仪检压法） ③检知pH值变化的滴定法 ④同位素跟踪测定法 （一）终点法条件 1．酶的底物特异性（专一性）：具有高度的底物专一性，有一些酶是呈族特异性； 2．反应的平衡 ： 酶反应若平衡十分偏向进行方向，则可方便地用终点测定法检测； 但若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或者偏向逆方向，此时由于反应不能完全，因而反应就不能正确定量，解决这一问题，通常可采取一些措施。 反应的平衡 谷氨酸+NAD++H2O a-酮戊二酸+NADH+NH+ 谷氨酸脱氢酶 NADH+丙酮酸 乳酸+ NAD+ 乳酸脱氢酶 3．反应液中的酶量 ：要使酶反应在短时间内完成，只有使用对底物亲和性很大的酶（即Km要小），酶用量（即Vmax）必须大才能达到此点。工作中，在10min内反应完成99%，则常数K以1.0min-1为宜。 4．反应产物抑制：如果产物对反应本身有抑制作用，则会妨碍反应进行，在这种情况下可将该产物除去或者和再生系统偶联等办法解决。 反应产物抑制 S+ATP P+ADP 丙酮酸 丙酮酸激酶 磷酸烯醇式丙酮酸 S激酶 （二）终点法种类 1．单酶反应定量法： （1）底物减少量的测定：在以待测物质为底物的酶反应中，如果底物能接近完全地转化为产物，且又具有某种特征性质（例如特征的吸收谱带）时，则就可能简便地通过直接测定底物的减少量，而定量待测物。 （二）终点法种类 （2）产物增加量的测定：在以被测物为底物的酶的反应中，如果底物基本上都能转变为产物，而产物又具有可以专一地进行定量测定的性质，那么根据产物增加就能检知底物的量。 （3）辅酶变化量的测定：以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶反应，通过测定340nm吸收度的变化，就能对作为相应脱氢酶底物的物质进行定量分析。 1. 羟基丙酮酸的定量测定 羟基丙酮酸+NADH+H D—甘油酸 +NAD+ L-谷氨酸+NAD++H2O 甘油酸脱氢酶 2. L-谷氨酸的定量测定 a-酮戊二酸+NADH+NH4+ 谷氨酸脱氢酶 2．和指示酶反应偶联的定量法 （1）以脱氢酶为指示剂：用来作为偶联指示剂的酶中应用得最广泛的是以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶类 （2）以脱