大鼠弥漫性脑损伤后脑源性及胶质细胞源性神经营养因子时序性表达的实验研究.docVIP

大鼠弥漫性脑损伤后脑源性及胶质细胞源性神经营养因子时序性表达的实验研究 　　[摘要] 目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和脑源性神经营养因子（BDNF）在大鼠脑组织中的表达水平随损伤时间的变化规律，以期为脑损伤时间的推断提供新的实验依据。 方法 将90只无特定病原体（SPF）SD大鼠随机分为正常对照组（n=10）及实验组（n=80），对实验组大鼠建立改良的大鼠弥漫性脑损伤模型，并根据伤后时间分为1、3、6、12、24、48、72、120 h组，每组各10只。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠脑组织中GDNF和BDNF表达，比较各组大鼠脑组织不同部位及损伤时间GDNF、BDNF的表达和变化规律。 结果 大脑、小脑、脑干组织中GDNF和BDNF阳性信号灰度在损伤后1 h组表达升高，6 h组达最高峰，12 h组开始回落；1、3、6、12、24、48、72、120 h组大脑、小脑、脑干组织中GDNF阳性信号灰度值均显著高于正常对照组（P 0.05）。 结论 BDNF、GDNF可以作为大鼠弥漫性脑损伤后经过时间推断的实验指标。 　　[关键词] 胶质细胞源性神经营养因子；脑源性神经营养因子；免疫组织化学；图像分析 　　[中图分类号] R651.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（a）-0017-04 　　颅脑损伤时间的推断是法医病理工作者一直致力解决的问题。目前尚未找到可应用于法医检案的切实可行的生物学指标。本实验采用改良大鼠弥漫性脑损伤模型[1]，应用免疫组织化学方法和图像分析法探讨胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neuro trophic factor，GDNF）和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在弥漫性脑损伤脑组织不同部位的表达水平随损伤时间的变化规律及其相关性，以期为寻找脑损伤时间推断提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　SPF级SD大鼠90只由中山大学基础医学院实验动物中心提供[SYXK（粤）2007-2008]，雄雌不限，体重：（250±10）g。随机分为正常对照组（n=10）及实验组（n=80），对实验组大鼠建立改良的大鼠弥漫性脑损伤模型，并根据伤后时间分为1、3、6、12、24、48、72、120 h组，每组各10只。 　　1.2 实验试剂与仪器 　　免疫组织化学试剂兔抗鼠GDNF一抗来自美国Santa Cruz Biotechnology Inc公司；兔抗鼠BDNF一抗来自武汉博士德公司；SP试剂盒及DAB显色试剂盒均来自福建麦新公司。病理图像分析采用中山大学法医系YC.TY-2050型法医病理图像分析系统，定量测量（灰度域0～256，0为白，放大倍数200×）。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 取材及处理 参照本研究组前期改良大鼠弥漫性脑损伤实验模型建立[1]的实验方法，并用本研究前期自制的打击装置对实验组大鼠造成脑损伤。实验组按时间段分别用2%戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉断颈取完整脑组织（图1、2）；正常对照组大鼠麻醉后断颈取脑。所有取材均用10%甲醛固定72 h，在大脑正中外侧1～2 mm处作矢状切面，同一切面取大脑、小脑、脑干3个部位，取材厚度约5 mm，石蜡包埋，切片厚度约2 μm，分别进行常规HE染色。 　　1.3.2 免疫组织化学实验 常规脱腊至水，采用高压修复抗原的方法，蒸馏水冲洗3 min×2次；3%H2O2室温处理20 min；PBS缓冲液冲洗3 min×3次；血清封闭37℃水浴10 min；加入一抗（1∶200工作浓度），4℃冰箱过夜；4℃冰箱取出室温放置10 min后，37℃水浴20 min，PBS缓冲液洗5 min×3次；加入二抗，37℃水浴20 min，PBS缓冲液洗5 min×3次；加入链酶菌抗生素蛋白-辣根过氧化物酶复合物，37℃水浴20 min，PBS缓冲液洗5 min×3次；DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。以PBS替代一抗作为阴性对照。 　　1.3.3 图像分析 每张切片随机取5个视野，分别测量GDNF、BDNF阳性反应物面积密度、灰度值。 　　1.4统计学方法 　　采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P 0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 HE染色结果分析 　　脑组织损伤呈全脑局部弥漫性分布，有出血、神经细胞肿胀、胶质细胞嗜酸性变、脑组织疏松、神经细胞变性坏死、嗜神经现象。在1、3 h 组出血改变较为明显，其