蛋白质免疫印记技术实验报告.docVIP

实验二 蛋白质免疫印迹技术 河北大学生命科学学院2010生物技术 河北 保定 071002 摘要：目的：学习掌握动物抗血清的制备原理及技术，通过实际操作学会动物抗血清的制备，掌握Western－blotting的基本原理，熟悉Western－blotting的实验操作?。方法：，使用鸡卵类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫，获得抗血清 ，然后利用Western－blotting 检测抗血清 。结果：纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应. 关键词：常规免疫 抗血清 免疫印记 Abstract：objective：learn to master the theory and technology 如果你找到了答案，请贡献本词条释义，利人利己 释义贡献 返回编辑 technology of preparing animals’ antiserumby operating the experiment in person ,learn to prepare the animals’ antiserum , mastering the basic principles of Western－blotting, and being familiar with the experiment operation of Western－blotting. Methods : using chicken ovomucoid operating the routine immunization of , and obtain the antiserum, then detecting the antiserum through Western－blotting. Result:Purified chicken ovomucoid can lead to the laboratory rats immunoreaction Keywords: routine immunization antiserum Western－blotting 前言 免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。进行免疫之前必须具备可特异性识别目的蛋白质的单抗或多抗，以及含有目的蛋白质的粗制或纯化的样品。因此，免疫印迹可以从复杂抗原中检出特定的抗原或者从多克隆抗体中检出单克隆抗体，又可以对转移到固相膜上的抗原或抗体进行连续分析，以取得目的蛋白的定位、定性或定量。现在，免疫印记技术，在对人的病理研究上，也有了很大的应用，免疫印记法检测细胞中癌基因的表达及其意义 免疫印记法检测宫颈液基细胞中HPV16、18 E6癌基因的表达及其意义 佐剂（完全佐剂 不完全佐剂）酒精棉球 冰箱 离心机 1.2 Western Blot 12%分离胶，3.6%浓缩胶 马斯亮蓝 脱色液 PVDF膜 甲醇 电泳缓冲液 封闭液（0.5%BSA、TBST溶液） 一抗（自制多克隆抗血清以TBST按1:100比例稀释） 二抗（羊抗鼠，按1:1000比例 用TBST稀释） DAB显色液 蒸馏水 镊子 烧杯 海绵垫 2 方法 2.1 小鼠的常规免疫和抗血清的制备 （1）抗原的提取与制备 1）抗原为纯化的鸡卵类粘蛋白 2）利用苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠背部 （2）初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠 1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态 2）用酒精棉球消毒待注射部位 3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL 初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫 （3）加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠 1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。 2）用酒精棉球消毒待注射部位 3 ）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。 （4）第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。 （5）收集抗血清（第二次加强免疫后一周后） 小鼠取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，析出血清，离心，3000rpm,10min。吸出血清，分装（0.05～0.2mL），贮于-20℃以下冰箱保存。 2.2 Western blotting检测抗血清 1.抗原SDS 凝胶的制备：12%分离胶，3.6%浓缩胶 抗原样品的制备：蛋白样品与