奶牛催乳素基因多态性及其与产奶性状的关联解析.docVIP

奶牛催乳素基因多态性及其与产奶性状的关联解析 　　催乳素( prolactin，PRL) 是一种主要由垂体前叶分泌的单链多肽类激素。与促肾上腺皮质激素、生长激素同为应激反应中腺垂体分泌的三大激素。牛PRL 基因位于23 号染色体上，由5 个外显子和4 个内含子组成。PRL 通过与靶细胞表面的催乳素受体( prolactin receptor， PRLR ) 结合，从而启动JAK2 /STAT5 信号传导通路，进而激活STAT5 因子，使其作用于乳蛋白基因启动子区的靶序列，启动或增强以乳蛋白基因启动子为作用元件的靶基因的表达。Lewin 等于1992 年在PRL 基因外显子3 上发现了突变，随着检测方法的成熟与发展，国内外学者关于PRL 基因的研究日渐丰富。曹新等于2002 年首次克隆得到牛PRL 基因的全长序列，袁峰等在水牛群体中研究PRL 基因外显子2 的多态性，李吉涛等对PRL 基因非编码序列与奶牛产奶性状相关研究，贾祥捷等在牛PRL 基因5#39;侧翼序列中发现2个多态位点，郑新宝等在新疆地区中国荷斯坦中验证了PRL 基因外显子3 多态性对泌乳性状有影响。国外学者中Khaizaran 等、Alfonso 等分别在不同地域和品种的泌乳牛群体中证实PRL 基因多态性对泌乳性状的影响。学者们对于荷斯坦等泌乳牛PRL 的研究多集中于其外显子3 和外显子4 上，而对于非编码序列的研究则较为少见，本研究以中国北方寒区澳系荷斯坦奶牛群体PRL 基因5#39;侧翼区调控序列为研究对象，通过PCR - RFLP 结合测序技术寻找该序列上的突变位点，结合基因型检测结果，分析不同基因型个体在泌乳性状间的差异，从而判断该群体中PRL 基因5#39;侧翼调控序列多态性与奶牛泌乳性状之间是否存在关联性，为该群体今后的选育工作提供参考，也为进一步开展奶牛PRL 基因非编码序列上潜在遗传标记的研究提供基础数据。 　　1 材料与方法 　　1. 1 试验牛群 　　以黑龙江省密山市8511 农场某规模化牧场内的澳系荷斯坦奶牛为试验种群，筛选在第Ⅰ到第Ⅲ泌乳期共计163 头母牛，尾静脉采血10 mL，与抗凝剂柠檬酸钠( ACD) 均匀混合后-20℃保存。使用购自北京康为世纪生物科技有限公司的血液基因组柱式小量提取试剂盒( 0. 1 ～1. 0 mL) 提取样品基因组DNA，溶于试剂盒提供的GE buffer 中， -20 ℃冻存。 　　1. 2 泌乳性状数据收集 　　泌乳性状数据源自采血奶牛近3 年的生产记录和DHI 报告，通过Excel 整理筛选出163 份完整的记录作为有效数据。 　　1. 3 目的片段的扩增 　　参考GenBank 上牛PRL 基因5#39;侧翼调控区序列( GenBank 登录号: X16641. 1) ，使用Primer 5. 0 软件设计引物，引物序列为F: 5#39; - AAGCCTTTTACATTATTTCAA- CCC - 3#39;，R: 5#39; - AATTCTCTGACCTCAAGCCACTCT- 3#39;，由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。目的片段位于参考序列第119 ～ 1 121bp，其长度为1 103 bp。PCR 反应体系为25 mu;L: 2 times; Es Taq MasterMix( 含染料) 12. 5 mu;L，Rnase - free 水10. 5 mu;L，上下游引物( 10 mu;mol /L) 各0. 5 mu;L，DNA 模版1 mu;L。反应程序: 94 ℃ 预变性4 min; 94 ℃ 变性30 s，52. 7℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，37 个循环; 72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。 　　1. 4 RFLP 检测 　　取PCR 产物4 mu;L，限制性内切酶HhaⅠ1 mu;L，10 times; NEBuffer 1 mu;L，Rnase - free 水4 mu;L 混匀，37 ℃水浴15 min，加入1 mu;L 10 times; Loading buffer 混匀后上样于1%琼脂糖凝胶中，120 V 电泳25 ～ 30 min 后在Bio - Rad 凝胶成像系统中观察酶切产物的电泳结果并拍照保存。 　　1. 5 测序和BLAST 比对 　　选取PCR 产物酶切结果不同的个体血样，按照测序要求准备PCR 产物及引物，送往哈尔滨博仕生物技术有限公司进行测序，待测序结果返回，通过NCBI 上的在线BLAST 软件进行序列比对。 　　1. 6 统计方法 　　通过MEGA 4. 0 的Clustal W 功能将测序结果与参考序列进行比对，使用POPGENE32 软件计算基因型频率、基