酒曲糖化酶活力的测定.docVIP

酒曲糖化酶活力测定的实验方案 一、实验原理 固体曲中糖化酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）能将淀粉水解为葡萄糖，进而被微生物发酵，生产酒精。糖化酶活力高，淀粉利用率就高。可溶性淀粉经糖化酶催化水解产生葡萄糖，用斐林试剂法测定。二、仪器试剂 ⒈仪器:烧杯，量筒，容量瓶，250ml锥形瓶，碱式滴定管，试剂瓶， 移液管 ⒉试剂：（1）20g/L 可溶性淀粉溶液：准确称取绝干计的 可溶性淀粉2g（准确至0.001g），于50mL烧杯中，用少量水调匀后，倒入盛有70mL沸水的烧杯中，并用20mL水分次洗涤小烧杯，洗液合并其中，用微火煮沸到透明，冷却后用水定容至100mL，当天配置使用。（2）1g/L葡萄糖标准溶液：准确称取预先在100~105℃烘干的无水葡萄糖1g(准确至0.0001g)溶解于水，加5mL浓盐酸，用水定容至1L。（3）斐林试剂 甲液：称取15g硫酸铜（）0.05g亚甲基蓝，溶于水并稀释 至 1L。 乙液：称取酒石酸钾钠，54gNaOH，4g亚铁氯化钾溶于水并稀释至1L。 （4）乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6）a.2mol/L 乙酸溶液：取118mL冰乙酸，用水稀释至1000mL。B.2mol/L 乙酸钠溶液：称取272g乙酸钠（CH3COOH·3H2O），溶于水并稀释至1000mL。将a，b等体积混合，即为pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液。（5）0.5mol/L H2SO3 溶液：量取28.3mL 浓硫酸，缓慢倒入水中并稀释至1L。（6）1 mol/L NaOH 溶液。三.测定步骤（1）5%干曲浸出液制备称取相当于5g的干曲的曲粉（准确至0.01g）［曲粉量（g）=5×1/（1－水分含量）］，置于250mL烧杯中，加水（90－5×水分%）mL，缓冲液10mL，在30℃水浴中浸出1h，每隔15min 搅拌1次。然后用干滤纸过滤，弃去最初5mL，接收50mL澄清滤液备用。（2）糖化液制备吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min后，准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。立即加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，以停止反应。再冷却到室温，用水定容至刻度线。此时溶液应呈碱性。空白液制备：吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min后，先加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，再准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。冷却到室温，定容。此时溶液应呈碱性。（3）糖分测定斐林试剂法，先取适量糖化液于斐林试剂中，用标准葡萄糖溶液滴定。四 数据记录与结果计算糖化酶活力定义：1g 干曲在35℃、pH4.6条件下，反应1h，将可溶性淀粉分解为葡萄糖1mg 所需的酶量称为1个酶活单位（U/g）。糖化酶活力（U/g）= 1.斐林试剂的标定 平行测定次数 1 2 3 斐林试剂的体积 10.00 10.00 10.00 消耗葡萄糖标准溶液体积 15.40 15.56 15.36 葡萄糖标准溶液浓度 0.09008 0.08915 0.09031 斐林试剂的浓度 1.387 1.387 1.387 斐林试剂平均浓度 1.387 糖化酶活力测定 平行测定次数 1 2 3 斐林试剂的体积 10.00 10.00 10.00 加入糖化液体的体积 5.00 5.00 5.00 消耗葡萄糖标准溶液体积 7.12 7.36 7.46 葡萄糖标准溶液浓度 0.0001924 0.0001885 0.0001859 斐林试剂的浓度 49.56 47.27 44.84 斐林试剂平均浓度 47.22 五 实验结论与总结： 1、实验结论：本次试验失败，通过计算得到，菲林试剂的浓度值是一样的，查 国标得到计算的糖化酶活力偏低，所以实验失败。 2、实验总结：1.称量药品时操作不规范，误差较大。 2.移取药品时取用不同的移液管导致缓冲溶液瘦污染，浓度降 低。 3.在滴定时候忘记加入指示剂。 4.在水浴中保温时间没到到。