酶工程教案.docVIP

兰州信息工程中等专业学校实验课教案 课程名称：酶工程 授课教师姓名及职称：尤佳 助教 一、授课题目 实验一 产木聚糖酶菌株的培养基产酶条件优化及产酶历程 二、授课对象 2011级口腔 三、实验教学目标与课时分配 1.了解观察菌株发酵过程中菌生长变化情况2.测定不同原料对菌种产酶的影响，确定最佳的产酶条件； 3.测定发酵过程中形成变化情况发酵过程中形成变化情况 课程负责人（签字） 年 月 日 年 月 日 一、实验目的1.了解观察菌株发酵过程中菌生长变化情况2.测定不同原料对菌种产酶的影响，确定最佳的产酶条件； 3.测定发酵过程中形成变化情况molecular structure of xylan 由于木聚糖结构的复杂性，木聚糖的完全水解需要多种酶的协调作用。无论是细菌、真菌还是放线菌中，都有人报道多种木聚糖酶的存在，木聚糖酶（Xylanase） D-木聚糖酶（EC3.2.1.8）随机断裂木聚糖骨架，产生木寡糖， 表1 木聚糖降解酶系及其作用特点作 Table1 1: The system of xylanase and their characteristic 木聚糖酶降解体系 作用特点 β－１,４－D－木聚糖内切酶 负责木聚糖的主链骨架的降解 β－１,４－D木糖苷酶 负责木寡糖的进一步降解 β－１,４－D葡萄糖苷酶 负责木聚糖的支链的降解 α-L-阿拉伯糖苷酶，α-D-葡萄糖醛酸酶 负责木聚糖的支链的降解 α-D-半乳糖苷酶， 脂酶 负责木聚糖的支链的降解 降低木聚糖的聚合度，然后由外切酶β-木糖苷酶（EC3. 2. 1. 37）将木寡糖和木二糖分解为木糖。侧链取代基的存在能阻抑木聚糖酶的作用，因此需要不同的糖苷酶水解木聚糖与侧链取代基之间的糖苷键，如α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸酶、乙酰脂酶和阿魏酸脂酶。通过研究揭示，这些特异性糖苷酶能以协调方式与内切木聚糖酶和β-木糖苷酶一起高效分解木聚糖。 木聚糖酶的生产方法主要集中在黑曲霉、烟曲霉、青霉以及细菌等菌种的液体发酵生产上，通过培养基的优化组合，选择出优质、廉价、高效的产酶培养基，并进行工业化的生产。本实验从液体深层发酵产酶条件优化的角度对一株黑曲霉进行产酶研究，探讨培养基的产酶方案，了解工业化酶工程生产的基本过程。 三、材料与方法 1 材料 1.1 菌种 黑曲霉mL） 60个，搪瓷缸（1000mL） 1个，纱布，棉塞（若干），25 mL容量瓶20个，50 mL容量瓶20个，振荡培养箱 1台，25mL试管若干，分光光度计 1台，离心机 1台，离心管（10mL）10个，胶头滴管 10支，精密酸度计 1台，天平（精确0.0001g和0.01g） 各一台，记号笔 1支，水浴锅 1个，高压灭菌锅 1台，电炉 1个，烧杯50mL、100mL、200mL 各10个，漏斗 5个，秒表 1个，冰箱 1台。 1.3 药品 桦木木聚糖，蛋白胨，马铃薯，蔗糖，木聚糖，麸皮，氯化钠（NH4）2SO4，KH2PO4，Mg SO4 ·7H2O，Tween80，尿素氯化钙HCl，NaOH，3,5-二硝基水杨酸苯酚亚硫酸钠酒石酸钾钠.1培养基发酵培养NaNO3 0.4 Na2HPO40.1 MgSO4.7H2O 0.03 FeSO4.7H2O 0.01 CaCO3 0.5 PH 6.7（消前）灭菌条件121℃，30min。 2.2产酶试验 将斜面培养基的菌种接一环孢子加入基础产酶培养基，用250ｍ三角瓶装液50ｍＬ，旋转式恒温振荡器转速220r/min, 30℃培养48小时，按下面所述的方法测定木聚糖酶活。 2.3 酶活测定方法 取0.1ml适当稀释的粗酶液，加入0.1ml 2 %桦木木聚糖溶液（用0.2M的Hac-NaAc缓冲液配制，pH 4.6）,在50℃保温15分钟后，加入0.6ml DNS溶液，煮沸10分钟灭活显色，定容到5ml，在550nm波长下测定还原糖量（以木糖计），以灭活的酶液作为对照。 酶活定义：在上述条件下，每分钟产生1微摩尔木糖所需要的酶量为一个酶活单位（IU/ml）。 酶活E=1.53 D×Y 其中E—木聚糖酶的活力，IU/ml，D—酶液的稀释度，Y—吸光值 四、实验设计 每做2个平行，每个平行做个重复，酶活力、发酵液pH，并观察发酵液的变化情况，记录之。 1.2.1不同单一氮源的影响 在产酶基础培养基中，将蛋白胨分别换成不同的氮源。有机氮源含量为0.5%，无机氮源以氮元素含量0.2%计。 氮源（%） 木聚糖酶酶活力（IU/ml） 氮源（%） 木聚糖酶酶活力（IU/ml） （NH4）2SO4